[發明專利]一種測定血清中藥物活性成分的方法

有效

• 申請號: 200910049665.0
• 申請日: 2009-04-20
• 公開（公告）號: CN102486472A
• 公開（公告）日: 2012-06-06
• 發明（設計）人: 張衛東;丁建彌;柳潤輝;陳忠樑;姜鵬;徐瑞林;張正光;孫志男;潘芳芳
• 申請（專利權）人: 上海和黃藥業有限公司
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種測定血清中藥物活性成分的方法，其特征是采用高效液相色譜-質譜聯用的方法，分析給藥后血清、空白血清及藥物的提取液，測定藥物活性成分及藥物活性成分的含量；包括以下步驟：

(1)配制藥物提取液：

取藥物粉末，用混合溶劑超聲提取后12000r/min離心，過濾，得藥物提取液；

(2)制備空白血清樣品：

羧甲基纖維素鈉用純水制成混懸液，動物灌胃給藥后，取靜脈血，置涂肝素鈉的EP管中，離心，沉淀蛋白后，上清液真空旋轉蒸干，得空白血清樣品；

(3)制備給藥后血清樣品：藥物碎成細粉后，用0.5％的羧甲基纖維素鈉制成混懸液，藥物的濃度為0.34g/ml，SD大鼠給予藥物混懸液灌服3.4g/kg大鼠體重，服藥0.5-3小時后，大鼠腹腔注射1％的戊巴比妥鈉溶液麻醉，0.15ml/kg大鼠體重，取靜脈血，置涂肝素鈉的EP管中，4℃條件下，3000r/min離心10min；取上清液400μl，加入5ml?EP管中，沉淀蛋白，渦旋1min，12000r/min離心10分鐘，上清液真空旋轉蒸干，殘渣加入200μl甲醇復溶，離心；上清液即給藥后血清樣品；

(4)高效液相色譜-質譜聯用分析：

色譜柱：Waters?Symmetry?C₁₈色譜柱，5μm，250mm×4.6mm；流動相為甲醇-水系統、乙腈-水系統、乙腈-0.5％乙酸水溶液或乙腈-0.5％甲酸水溶液；流速0.8mL/min；柱溫25℃；電噴霧離子化源ESI，源電壓3.5kv；干燥氣流速10L/min；干燥氣溫度350℃；噴霧氣壓力30psi；MS/MS打碎電壓1.0V，掃描的范圍為100-1500u，分別采集正離子和負離子模式下的MS和MS/MS圖譜；

(5)比較給藥血清和空白血清的質譜圖，扣除空白血清中的內源性成分，得給藥后血清中的差異性成分，即所測得的藥物的活性成分。

2.按權利要求1所述的測定血清中藥物活性成分的方法，其特征是所述藥物為治療心血管疾病的復方中藥。

3.按權利要求1所述的測定血清中藥物活性成分的方法，其特征是所述藥物為麝香保心丸，國藥準字Z31020068，主要含含下述原料藥組分：麝香、人參提取物、人工牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥、冰片。

4.按照權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟1的混合溶劑為甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V，超聲時間為20min。

5.按照權利要求1所述的方法，其特征是，所述方法中，制備空白或給藥血清樣品，采用灌胃后2小時從肝門靜脈取血，每400μl血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流動相為乙腈：0.5％甲酸水溶液。

6.按照權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟5)的差異性成分以下述16個共有色譜峰的保留時間Rt值、分子量、一級質譜離子數據和二級質譜離子數據表示：

7.按照權利要求6所述的方法，其特征是：產生的所述的藥物的活性成分，分別為：日本蟾蜍它靈，人參皂苷Re，1β-羥基蟾毒靈，人參皂苷Rb1，人參皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人參皂苷Rc，人參皂苷Rb2，人參皂苷Rb3，人參皂苷Rd，蟾毒靈，膽酸，豬去氧膽酸，華蟾酥毒基，鵝去氧膽酸，去氧膽酸。