[發(fā)明專利]一種利用高通量測(cè)序單通道復(fù)用技術(shù)進(jìn)行microRNA表達(dá)譜測(cè)定的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910049381.1
• 申請(qǐng)日: 2009-04-15
• 公開（公告）號(hào): CN101864477A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉極龍;曾華宗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海聚類生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本專利涉及一種在適用于超高通量新一代測(cè)序的單通道復(fù)用技術(shù)，可以在單通道中同時(shí)定量多個(gè)樣本microRNA表達(dá)譜。

背景技術(shù)

微小核糖核酸(microRNA或miRNA)是一種長(zhǎng)度為～22nt的非編碼RNA。在線蟲、擬南芥、果糖、人類等動(dòng)植物細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)。在生物體內(nèi)，microRNAs基因是由RNA聚合酶II(Pol?II)或RNA聚合酶III(Pol?III)轉(zhuǎn)錄而生成含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRNAs(primary-miRNAs，pri-miRNAs).pri-miRNAs隨后分別由Drosha和Dicer切割加工成大約22nt的miRNA雙鏈體(duplex).雙鏈體中的功能鏈進(jìn)miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRNA-induced?silencing?complex，miRISC)中，通過堿基對(duì)相互作用指導(dǎo)復(fù)合物識(shí)別靶標(biāo)分子的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated?regions，3’-UTRs)，對(duì)靶mRNAs進(jìn)行調(diào)控.miRNAs對(duì)于靶分子的調(diào)節(jié)包括兩種方式，一種是直接對(duì)靶mRNAs進(jìn)行降解，另一種方式是通過抑制靶mRNAs的翻譯來實(shí)現(xiàn)調(diào)控的。microRNA以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式精細(xì)調(diào)節(jié)著個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖、分化、代謝，以及病毒感染等生命活動(dòng)和細(xì)胞過程(]L.P.Lim?etal.，The?microRNAs?of?Caenorhabditis?elegans.Genes?Dev.17(2003)，pp.991-1008)。

越來越多的研究證實(shí)microRNA也是癌癥的遺傳標(biāo)簽。它們與癌癥的發(fā)生和晉級(jí)有關(guān)。microRNA可以作為癌癥的分子標(biāo)志物和也是潛在的治療藥物靶點(diǎn)(Mallardo?M，Poltronieri?P，D′Urso?OF.Non-protein?coding?RNA?biomarkers?and?differential?expression?in?cancers：a?review.J?Exp?Clin?Cancer?Res.2008Jul?16；27：19.)。

常規(guī)的microRNA檢測(cè)方法包括northern雜交、原位雜交、實(shí)時(shí)定量PCR等。基因芯片是常用的高通量的檢測(cè)方法。然而隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于測(cè)序的高通量microRNA定量技術(shù)日益顯示出優(yōu)勢(shì)來。

目前市場(chǎng)上有四種高通量測(cè)序儀，分別是Solexa，454(GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根據(jù)測(cè)序原理，它們可以被分為兩大類：使用合成法測(cè)序(Sequencing?by?Synthesis)的Solexa和454，及使用連接法測(cè)序(Sequencing?by?Ligation)的Polonator和SOLiD。在定量microRNA表達(dá)譜的應(yīng)用中，基本步驟是將microRNA樣本進(jìn)行預(yù)處理后，利用這些高通量測(cè)序儀直接進(jìn)行并行測(cè)序。然后根據(jù)測(cè)得序列的種類和個(gè)數(shù)，便可以準(zhǔn)確計(jì)算每個(gè)microRNA的表達(dá)量。基于測(cè)序的microRNA表達(dá)譜定量技術(shù)克服了傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)存在的非特異雜交和噪音背景較高的特點(diǎn)，具有更好的重復(fù)性和敏感性。

然而基于新一代測(cè)序技術(shù)的microRNA表達(dá)譜定量技術(shù)存在這樣的問題：1.價(jià)格仍然過高；2.八個(gè)通道的并行性對(duì)于大規(guī)模的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)仍顯不足；3.由于單通道可以測(cè)得超過3000000個(gè)microRNA序列，而每個(gè)細(xì)胞大約只有50000個(gè)拷貝，因此測(cè)序深度大約為60倍，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過定量的要求，造成一定程度的浪費(fèi)。

一次我們?cè)O(shè)計(jì)的方法用條碼標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同的生物樣本進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后將樣本等量混合，然后進(jìn)行超高通量測(cè)序。增加單次實(shí)驗(yàn)并行的樣本數(shù)，并且節(jié)省了成本。

利用傳統(tǒng)microRNA芯片，在上樣量為1ug總RNA的情況下，一個(gè)10amol的microRNA基因大約90％的機(jī)會(huì)被檢測(cè)出來。這個(gè)濃度大約相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞100個(gè)拷貝(每個(gè)細(xì)胞的microRNA拷貝總數(shù)為50000)(Kim?VN.MicroRNA?precursors?in?motion：exportin-5mediates?their?nuclear?export.Trends?Cell?Biol.2004Apr；14(4)：156-9)。對(duì)于基于測(cè)序技術(shù)的microRNA表達(dá)譜定量，我們要獲得與microRNA芯片同樣的敏感度，我們假設(shè)至少要測(cè)出n個(gè)序列，那么需要滿足