[發明專利]一種檢測魚類精子質膜損傷的方法

無效

• 申請號: 200910048126.5
• 申請日: 2009-03-24
• 公開（公告）號: CN101846638A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 黃曉榮;章龍珍;莊平;江琪;姚志峰;劉鑒毅;張濤;馮廣朋;趙峰;閆文罡
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: G01N21/952
• 分類號: G01N21/952
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 歐陽俊立

技術領域

本發明屬水產養殖技術，涉及到魚類精子質膜損傷的檢測方法。

背景技術

在養殖生產中常常需要對魚類進行催產繁育，魚類精子質量的好壞是繁育中非常重要的一個環節，直接影響受精率、孵化率和成活率。魚類精子排出體外后，其活力容易受到外界各種環境因子的影響，不同的環境條件(溫度、光照等)都會對精子造成一定損傷，從而影響精子的質量，降低受精率、孵化率和成活率，給養殖生產帶來極大損失。精子質膜是包在精子頭部外面的一層膜，具有豐富的膜蛋白，在受精過程中起著非常重要的作用，但這層膜對外界環境因子極為敏感，容易受到損傷導致破裂或脫落。目前檢測魚類精子質膜損傷的方法是通過掃描電鏡和透射電鏡進行觀察，但這種方法只能從外觀進行定性觀察，不能定量分析和統計，且儀器價格昂貴。

發明內容

本發明要解決的問題是提供一種檢測魚類精子質膜損傷的方法。

本發明采集一定數量的魚類新鮮精子和經過低溫處理的精子，其特征是將新鮮精子和經過低溫處理的精子分別收集到10mL的離心管中，800×g離心5min，棄去上清液，用緩沖液稀釋，使待測樣本精子數為(2～3)×10⁵·mL^-1；

加入2uL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800×g離心5min，再用緩沖液重新懸浮精子，使精子細胞濃度為1-2×10⁵·mL^-1；取195μL精子懸液，加入5μLAnn-FITC，在室溫下孵化10min，然后加入10μLPI染液，室溫下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測，流式細胞儀氬離子激發光波長為488nm，光源為200mw；用Cel-lquest?9.3版檢測每個精子的前向角散光和側向角散光；用波長為520nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于610nm的濾器檢測PI；在精子凋亡早期位于質膜內側的磷脂酰絲氨酸遷移至質膜外側，可與一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白V相結合；因此，將Annexin?V標記上熒光素可以作為探針檢測暴露在質膜外側的磷脂酰絲氨酸；同時結合使用碘化吡啶PI進行雙染色后，用流式細胞儀即可檢測質膜完整的正常活精子、質膜損傷的凋亡精子及質膜完全破裂的壞死精子。

本發明與現有技術相比，本發明通過采用熒光雙染法對受到不同損傷的精子進行染色，經過前處理后直接用流式細胞分析儀進行檢測，可定量區分質膜完整的精子和質膜不完整的精子，結果更直觀，更可靠。

具體實施方式

在魚類的繁殖季節，采集一定數量的魚類新鮮精子和經過低溫處理的精子，將這2份精子分別收集到10mL的離心管中，800×g離心5min，棄去上清液，用緩沖液(Annexin?V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)稀釋，使待測樣本精子數為(2～3)×10⁵·mL^-1。

加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800×g離心5min，再用緩沖液重新懸浮精子，使精子細胞濃度為1-2×10⁵·mL^-1。取195μL精子懸液，加入5μL?Ann-FITC(Annexin?V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)，在室溫下孵化10min，然后加入10μLPI染液，室溫下避光孵育10-15min。利用FACSCalibur型流式細胞儀(Becton?Dickinson，San?Jose，CA，USA)檢測，流式細胞儀氬離子激發光波長為488nm，光源為200mw。用Cel-lquest?9.3版(Becton?Dickinson，San?Jose，CA，USA)檢測每個精子的前向角散光(ESC)和側向角散光(SSA)。用一波長為520nm的通帶濾器檢測FITC熒光(FL1)，另一波長大于610nm的濾器檢測PI(FL3)。在精子凋亡早期位于質膜內側的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至質膜外側，可與一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白V(Annexin?V)相結合。因此，將Annexin?V標記上熒光素可以作為探針檢測暴露在質膜外側的磷脂酰絲氨酸。同時結合使用碘化吡啶PI進行雙染色后，用流式細胞儀即可檢測質膜完整的正常活精子、質膜損傷的凋亡精子及質膜完全破裂的壞死精子。

質膜有損傷的精子DNA可被PI染色產生紅色熒光，質膜保持完好的精子則不會有紅色熒光產生。因此，在雙變量流式細胞儀的散點圖上，上方兩個象限為PI陽性，表示精子質膜不完整，為非活性精子；下方兩個象限精子質膜完整，為活性精子。每個待測樣本檢測200個精子，計算待測樣本質膜完整率。

運用此方法能準確檢測魚類精子的質膜損傷，可對質膜的完整率進行量化，結果更直觀，更可靠，檢測準確率達到99％以上。