[發明專利]一種檢測魚類精子質膜損傷的方法

無效

• 申請號: 200910048126.5
• 申請日: 2009-03-24
• 公開（公告）號: CN101846638A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 黃曉榮;章龍珍;莊平;江琪;姚志峰;劉鑒毅;張濤;馮廣朋;趙峰;閆文罡
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: G01N21/952
• 分類號: G01N21/952
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 歐陽俊立

1.一種檢測魚類精子質膜損傷的方法，采集一定數量的魚類精子，其特征是將精子收集到10mL的離心管中，800×g離心5min，棄去上清液，用緩沖液稀釋，使待測樣本精子數為(2～3)×10⁵·mL^-1；加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800×g離心5min，再用緩沖液重新懸浮精子，使精子細胞濃度為1-2×10⁵·mL^-1；取195μL精子懸液，加入5μLAnn-FITC，在室溫下孵化10min，然后加入10μL?PI染液，室溫下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測，流式細胞儀氬離子激發光波長為488nm，光源為200mw；用Cel-lquest?9.3版檢測每個精子的前向角散光和側向角散光；用波長為520nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于610nm的濾器檢測PI；將Annexin?V標記上熒光素作為探針檢測暴露在質膜外側的磷脂酰絲氨酸；同時結合使用碘化吡啶PI進行雙染色后，用流式細胞儀檢測質膜完整的正常活精子、質膜損傷的凋亡精子及質膜完全破裂的壞死精子。