[發明專利]一種三維轉移性肝癌類組織體外模型的構建方法

無效

• 申請號: 200910048099.1
• 申請日: 2009-03-24
• 公開（公告）號: CN101508973A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 崔杰峰;劉銀坤;唐建華;陳榮新;徐長德;康曉楠;郭坤
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 翁若瑩

技術領域

本發明涉及一種三維轉移性肝癌類組織體外模型的構建方法，屬于組織體外模型的構建方法技術領域。

背景技術

傳統的單層平面培養技術在癌癥體外細胞模型建立、癌細胞生物學行為分析中一直發揮著主導作用，但受細胞培養方法本身及癌細胞數次傳代的限制，細胞的形態、極性、基因表達乃至功能狀態與體內癌細胞的實際病理生理狀況相距甚遠，由此產生的兩維體外癌細胞模型在疾病分子病理機制的探討中受到越來越多的挑戰。近些年，體外三維培養技術進展及癌細胞生物學特性的深入研究，使得模擬體內組織細胞生長環境具有明顯優勢的立體培養，在癌細胞生物學特性解析、藥物療效的評估中受到普遍的關注。

單層平面培養時細胞由于受重力作用而自然沉降在支架材料上，使細胞貼壁而無極性，細胞的形態由球形轉為扁平狀，由此影響細胞的分泌功能及部分關鍵基因的異常表達，且單層平板培養無法反映細胞與細胞之間，細胞與基質微環境之間等多維的相互作用，從而缺少有利的實驗證據對細胞間粘附、信號轉導等生物學過程進行體外模擬研究，單層平板培養的細胞生物學特征與體內細胞真實的生理病理狀況也相去甚遠。三維立體培養技術克服了上述單層平板培養的不足，較好地模擬再現細胞在組織體內接近真實的生存狀況，對體外細胞生物學功能的深入解析產生有力的推動，在細胞功能研究上，體外三維立體培養技術具有明顯的優勢，主要包括(1)簡化宿主體內復雜生長環境，提供易于重復研究的特定體外模擬培養環境，有利于三維狀態下細胞的分化，生長等生理病理特征解析。(2)在特定培養體系中，提高了同種細胞、異種細胞間的相互作用，結構上易于建立起緊密的縫隙連接，橋粒連接。(3)增強胞外基質的產量，易于觀察胞外基質對細胞生長、分化、遷移等細胞生物特征的影響。(4)體現出分化細胞的基因表達狀況和相關功能特征。

RWV生物反應器的出現在三維培養的方法學進展上具有突破性的意義，該裝置是美國國家航空航天局科學家為評價微重力與液體低流速對細胞培養的潛在影響而發展起來的，它由一水平旋轉并能通過底部硅樹脂膜進行氣體交換的壁式組織培養器皿和旋轉控制器組成，通過對旋轉速度的調節形成低剪切、微重力體外環境，增強培養細胞的組織樣黏附與聚集，并對細胞的生長增殖，分化，細胞因子分泌及細胞間的相互作用產生影響。低剪切、微重力的體外培養環境使其明顯優于靜止及其它高剪切的旋轉三維培養技術，成為目前細胞三維培養最常用的技術之一，另外在多種細胞間的混合培養方面，該體系也具有明顯優勢。材料科學的進步與發展為三維細胞培養方法的提高與改進也提供了更多選擇，微載體珠，可降解生物支架是當前三維立體培養中應用較廣的兩種起機械支撐材料，前者的優勢在于能較大面積地促進細胞間的粘附聚集，尤其在不易發生自發聚集的細胞系，常規條件下難培養的細胞及敏感性高的細胞生物學功能的研究上有獨特的優勢，但微載體珠應用需聯合旋轉瓶或旋轉搖床培養而帶來的整合優化問題，以及形成假球形體中含有大的微載體珠是該法期待解決的難題。可降解生物支架引入三維培養主要利用其模擬胞外基質成分的性質和提供細胞培養中三維機械結構的支撐，常用生物材料包括膠原組分和合成聚合物(聚羥基乙酸或聚乙醇酸PGA，聚乙醇酸-乳酸共聚物PLGA)，這類生物材料應用于三維培養中可有效地提高體外細胞的長期生長、分化，而且其基質成分的性質也參與增強信號傳導過程而對關鍵細胞功能遷移、增殖、分化等產生影響，生物支架材料在三維培養中的應用是目前體外再生活組織天然結構和功能形成最理想的一種方法。

理想的體外腫瘤模型既能較好地模擬體內腫瘤的生存環境，也應有助于腫瘤細胞的惡性生物學行為的實驗解析。在肝癌體外轉移模型建立方面，復旦大學肝癌研究所進行了大量創造性的工作，先后建立了人肝癌裸小鼠移植模型(LTNM₁-LTNM₄)、人肝癌裸大鼠移植模型(LTNR₁、LTNR₂)，高轉移人肝癌裸小鼠模型(LCI-D20)、轉移潛能不同人肝癌細胞系(MHCC97L，MHCC97H，LM3，LM6)，上述轉移模型被國內外學者大量研究應用，對肝癌轉移復發分子機制的闡明起到積極的推動。但受技術和方法的限制，在體外肝癌腫瘤組織模型建立方面依然空白，而且從腫瘤細胞生物特性來看，體外多次傳代的二維貼壁培養腫瘤細胞易改變或丟失腫瘤細胞的某些表型特征、生物特性，且常出現基因水平表達模式、藥物篩查情況與臨床標本不一致的情況。

發明內容