[發明專利]一種聯合快速檢測流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910047186.5
• 申請日: 2009-03-06
• 公開（公告）號: CN101629215A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 曹廣文;李淑華;劉世建;常文軍;張宏偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王 巍

1、一種聯合快速檢測流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒，其特征在于所述試劑盒由主反應液和特異性引物組成：

所述主反應液的組成：10×等溫反應緩沖液、濃度為5U/μl的禽類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶、濃度為40U/μl的核酸酶抑制劑、濃度為8U/μl的Bst?DNA聚合酶、濃度為10mM的dNTP、濃度為100mM的硫酸鎂、和濃度為5M的酣菜堿和1.25μl焦碳酸二乙脂處理水，總體積量為16μl；

所述特異性引物：包括特異性引物1，特異性引物2，特異性引物3；每組特異性引物都共有3對引物，它們分別為內引物1FIP和內引物2BIP；外引物1F3和外引物2B3；環引物1FLP和環引物2BLP。

2、根據權利要求1的試劑盒，其特征在于所述主反應液的組成為：2.5μl?10×等溫反應緩沖液、1.0μl禽類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶5U/μl，0.25μl核酸酶抑制劑40U/μl，2.0μl?Bst?DNA聚合酶8U/μl，3.5μl?10mM?dNTP，1.5μl?100mM的硫酸鎂，4.0μl?5M的酣菜堿和1.25μl焦碳酸二乙脂處理水；總體積量為16μl。

3、根據權利要求2的試劑盒，其特征在于所述主反應液的10×等溫反應緩沖液為：濃度為200mM、pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、濃度為100mM的氯化鉀、濃度為100mM硫酸按、濃度為20mM的硫酸鎂和濃度為1％的曲拉通X-100。

4、根據權利要求1的試劑盒，其特征在于所述特異性引物1為特異性擴增乙腦病毒引物；特異性引物2為特異性擴增登革病毒引物；特異性引物3為特異性擴增西尼羅病毒引物；所述特異性引物2包括特異性擴增I型登革病毒引物、II型登革病毒引物、III型登革病毒引物，IV型登革病毒引物。

5、根據權利要求1的試劑盒，其特征在于所述特異性引物濃度分別如下：

所述乙腦病毒特異引物PJEV包括20μM內引物1PJEVFIP、20μM內引物2PJEVBIP、10μM外引物1PJEVF3、10μM外引物2PJEVB3，、20μM環引物1PJEVFLP和20μM環引物2PJEVBLP；

所述I型登革病毒引物PDV1包括20μM內引物1PDV1FIP、20μM內引物2PDV1BIP、10μM外引物1PDV1F3、10μM外引物2PDV1B3、20μM環引物1PDV1FLP、20μM環引物2PDV1BLP，總體積量為7μl；

所述II型登革病毒引物PDV2包括20μM內引物1PDV2FIP、20μM內引物2PDV2BIP、10μM外引物1PDV2F3、10μM外引物2PDV2B3、20μM環引物1PDV2FLP、20μM環引物2PDV2BLP，總體積量為7μl；

所述III型登革病毒引物PDV3包括20μM內引物1PDV3FIP、20μM內引物2PDV3BIP、10μM外引物1PDV3F3、10μM外引物2PDV3B3、20μM環引物1PDV3FLP、20μM環引物2PDV3BLP，總體積量為7μl；

所述IV型登革病毒引物PDV4包括20μM內引物1PDV4FIP、20μM內引物2PDV4BIP、10μM外引物1PDV4F3、10μM外引物2PDV4B3、20μM環引物1PDV4FLP、20μM環引物2PDV4BLP，總體積量為7μl；

所述西尼羅病毒特異引物PWNV包括20μM內引物1PWNVFIP、20μM內引物2PWNVBIP、10μM外引物1PWNV?F3、10μM外引物2PWNVB3、20μM環引物1PWNVFLP、20μM環引物2PWNVBLP，總體積量為7μl。