[發明專利]一種檢測氯霉素的酶聯免疫試劑及方法

無效

• 申請號: 200910045166.4
• 申請日: 2009-01-12
• 公開（公告）號: CN101526537A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 聶繼斌;唐俊;楊宏;溫俊梅;齊欣;吳青;李成;楊宗繁
• 申請（專利權）人: 深圳市綠詩源生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N33/566;G01N33/52;G01N33/535
• 代理公司: 深圳市深遠專利商標事務所
• 代理人: 褚治保

技術領域

本發明涉及酶聯免疫和獸藥殘留檢測分析技術領域中的一種檢測氯霉素的酶聯免疫試劑及方法。

背景技術

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是第一個采用化學合成法生產的抗生素，對多種病原菌具有較強的抑制作用。由于其效高價廉，曾被廣泛應用于各類家禽、家畜、蜜蜂和水產品的各種傳染病的防治。然而，氯霉素存在著嚴重的毒副作用，能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺癥以及新生兒、早產兒灰色綜合癥等，對人類健康構成巨大的潛在威脅。因此，氯霉素殘留問題已引起國際組織和許多國家及地區的高度重視。歐盟、美國等發達國家已相繼禁止氯霉素用于動物源性食品，并明確規定氯霉素殘留限量為不得檢出。

目前國內外的氯霉素檢測技術方法主要有微生物法、放射免疫法、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、質譜分析等，這些方法各有優劣，而酶聯免疫法(ELISA)具有特異性強、靈敏度高，樣品預處理簡單，檢測時間短、檢測樣本量大等優點。

發明內容

本發明的檢測原理：當包被原為氯霉素偶聯抗原時是將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白偶聯物(CAP-BGG)吸附于固相載體上，加入樣本或氯霉素標準品，然后加氯霉素特異性抗體，待測樣品中殘留的氯霉素和酶標板上包被的氯霉素抗原競爭氯霉素特異性抗體。再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出氯霉素的濃度。

包被原為抗抗體時是將抗抗體吸附于固相載體上，加入氯霉素特異性抗體，再加入氯霉素酶標記抗原和樣本或氯霉素標準品溶液，待測樣本中殘留的氯霉素和酶標記氯霉素抗原競爭氯霉素特異性抗體，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出氯霉素的濃度，與標準溶液顏色比較則可判斷樣品中氯霉素的濃度范圍。

本發明提供了一種檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯免疫試劑盒，它含有：

(1)包被氯霉素抗原的酶聯板或包被抗抗體的酶聯板；

(2)酶標記物；

(3)氯霉素特異性抗體；

(4)氯霉素標準品溶液；

(5)底物顯色液；

(6)終止液；

(7)濃縮洗滌液；

(8)濃縮復溶液。

本發明所述試劑盒中氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進行偶聯得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到。制備酶聯板過程中所用的包被緩沖液為批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被氯霉素抗原或抗抗體的載體物質可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為去離子水或三蒸水；所用的封閉液是含有8％-15％的馬血清和1％惰性蛋白的溶液。

本發明所述試劑盒中包被氯霉素抗原的酶聯板或包被抗抗體的酶聯板的制備步驟為：

(1)用包被緩沖液將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白(BGG)偶聯物或抗抗體以0.02-0.08μg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；

(2)向酶聯板的每孔中加入100μl已經稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍干；

(3)向酶聯板的每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。

以上方法制備的酶聯板具有很好的穩定性，經過冷熱穩定性試驗，酶聯板的相關技術參數均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。

本發明所述試劑盒中酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記氯霉素抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發明優選過氧化物酶；酶標記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標記物工作液所用的稀釋液為含有50％甘油(可防止放入-20℃環境的酶標記物凍結，亦可長時間保持酶標記物的生物活性)、1％的疊氮化鈉防腐劑(便于保存)的溶液。

本發明所述試劑盒中酶標記抗抗體的制備步驟為：

(1)抗抗體的制備：以鼠源性抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；或以兔源性抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。