[發(fā)明專利]用于柑橘潰瘍病菌檢測的引物對及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910044688.2
• 申請日: 2009-11-04
• 公開（公告）號: CN101712983A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱金國;陳小帆;王象賢;莫瑾;左靜
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國湖南出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/64
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及柑橘潰瘍病菌檢測用引物和檢測方法。?

背景技術(shù)

柑橘潰瘍病是由柑桔潰瘍病菌(Xanthomonas?axonopodis?pv.Citri)感染所致的重要的檢疫性病害，為國內(nèi)外檢疫對象，嚴重影響柑桔安全生產(chǎn)和對外貿(mào)易，已被我國國家質(zhì)檢總局列入2007年公布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。?

該病菌在葉、枝梢及果實的病斑中越冬，翌年春條件適宜時從病部溢出，借風(fēng)雨、昆蟲傳播，經(jīng)寄主的氣孔，皮孔和傷口侵入。使葉片、嫩梢和果實發(fā)病，目前還沒有一種有效根除該病菌的方法。我國多數(shù)甜橙和柚類產(chǎn)區(qū)此病有不同程度發(fā)生，在經(jīng)濟上造成損失最大的是柑橘。?

柑橘潰瘍病的檢疫目前大多以植株發(fā)病癥狀的觀察為主，在一般情況下完全可憑肉眼判斷，但許多抗病或非敏感品種缺乏明顯癥狀，易與其他病害混淆，同時由于黃單胞菌的種類及變種繁多，針對柑桔潰瘍病菌的生化鑒定十分繁雜和困難。目前國內(nèi)外針對柑橘潰瘍病菌的檢測技術(shù)研究基本建立在常規(guī)PCR和實時熒光PCR的基礎(chǔ)上，王中康等和H.D.Coletta-Filho設(shè)計了柑橘潰瘍病菌的檢測引物并采用常規(guī)PCR方法對該病菌進行了檢測，Vessela?Mavrodieva等應(yīng)用實時熒光PCR方法對柑橘潰瘍病菌進行了檢測方面的研究。?

雙重PCR技術(shù)可針對兩個不同區(qū)域的DNA序列進行檢測，大大提高DNA分子檢測的精準度，達到提高檢出率的目的。變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)是通過將待測的PCR核酸片段在緩沖液攜帶下流過專利的DNA分離柱，利用緩沖液的不同梯度變化，實現(xiàn)對不同大小核酸片段的分離和分析，由紫外檢測被分離的DNA樣品；并在部分變性的柱溫條件下通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間不同的原理，檢測分析DNA位點差異和突變，對結(jié)果進行更靈敏的分析和比對。目前尚沒有采用雙重PCR結(jié)合高效變性液相色譜(doublx?PCR-DHPLC)的技術(shù)對柑橘潰瘍病進行快速準確檢測的研究報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供用于柑橘潰瘍病菌雙重PCR-DHPLC檢測的引物和方法。?

本發(fā)明通過已報道的柑橘潰瘍病菌Xanthomonas?axonopodis?pv.citri?OPM-12?SCAR?fragment區(qū)域序列(gb|AF312370.1)設(shè)計了用于本發(fā)明的引物對SEQ?ID?NO.1和2，并結(jié)合Coletta-Filho等報道的引物SEQ?ID?NO.3和4對進行雙重PCR-DHPLC方法檢測柑橘潰瘍病菌，所述的兩對由正向和反向引物組成的引物對，其核苷酸序列分別為?

SEQ?ID?NO.1：5’-ACGCTCGATCTGCACCTATT-3’；?

SEQ?ID?NO.2：5’-CCAACGAGTCTCAAGCATCA-3’；?

SEQ?ID?NO.3：5’-CGCCATCCCCACCACCACCACGAC-3’；?

SEQ?ID?NO.4：5’-AACCGCTCAATGCCATCCACTTCA-3’。?

本發(fā)明還給出了應(yīng)用上述引物的雙重PCR-DHPLC方法，其以細菌DNA為模板，進行雙重PCR擴增，擴增后的PCR產(chǎn)物直接進行DHPLC分析。?

其反應(yīng)體系為：10×PCR?buffer?2.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，10μmol/L引物各1.0μL，Taq?DNA?polymerase(2U/μL)1.0μL，1ng/μL～10ng/μL，DNA模板5μL，滅菌超純水補足至25μL。?

其中，上述反應(yīng)條件可以是：96℃預(yù)變性5min；96℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)反應(yīng)30次；72℃延伸5min。?

DHPLC分析條件設(shè)定為：進樣量5μL，柱溫50℃，選擇全片段檢測程序進行檢測，流速0.9mL/min。?

本發(fā)明還建立了進一步對雙重PCR-DHPLC分析得到結(jié)果陽性的PCR產(chǎn)物進行鑒定的DHPLC分子鑒定體系和分子標本。即以設(shè)計的引物SEQ?ID?NO.1和2擴增柑橘潰瘍病菌菌株DNA的PCR產(chǎn)物作為PCR-DHPLC鑒定方法的標記物。未知擴增產(chǎn)物通過與該標記物進行半變性DHPLC分析可以對未知菌進行柑橘潰瘍病菌的鑒定。DHPLC檢測條件為：設(shè)定片段大小為236bp，每次進樣5μL，檢測溫度：Tm＝65℃，以流速0.9mL/min進行分析。?