[發(fā)明專利]一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強(qiáng)的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910044070.6
• 申請(qǐng)日: 2009-08-10
• 公開（公告）號(hào): CN101659962A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁德馨;李廣悅;王永東;劉劼;劉玉龍;胡南;王有團(tuán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C22B3/18;C22B60/02;C12R1/01
• 代理公司: 湖南省國防科學(xué)技術(shù)工業(yè)辦公室專利中心
• 代理人: 馮 青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種融合表達(dá)藤黃微球菌賦活促進(jìn)因子(resuscitation-promotingfactor，rpf)、新月柄桿菌cc3302基因以及芝田硫化葉菌ssh10b基因的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株的制備方法及在鈾礦浸出中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus?ferrooxidans，T.f)是重要的浸礦微生物之一，以氧化二價(jià)鐵、元素硫以及還原態(tài)硫的化合物等來獲得能量，在生長過程中產(chǎn)生三價(jià)鐵、硫酸等浸出劑，因此能降低生產(chǎn)成本，同時(shí)，氧化亞鐵硫桿菌能自我繁殖擴(kuò)增，可以循環(huán)利用，這樣就進(jìn)一步降低了消耗。因此，利用氧化亞鐵硫桿菌浸出金、銀、銅、鈾等的研究越來越受到重視。

雖然氧化亞鐵硫桿菌有著上訴優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)同樣明顯，主要體現(xiàn)在生長速度緩慢，高鈾離子濃度下氧化能力降低甚至死亡，最適生長溫度為30℃，在高溫下活性迅速下降。

藤黃微球菌賦活促進(jìn)因子具有促進(jìn)休眠細(xì)菌復(fù)蘇以及促進(jìn)細(xì)菌生長的作用，cc3302基因在新月柄桿菌耐鈾實(shí)驗(yàn)中表達(dá)增高了20余倍，與鈾抗性關(guān)系密切，而ssh10b基因表達(dá)的蛋白能與核酸緊密結(jié)合，使其能在高熱環(huán)境中維持螺旋狀態(tài)，防止高熱對(duì)核酸的破壞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株AcidithiobacillusferrooxidansQEY-6(pJRD215-PT-rcs)，該菌株可以融合表達(dá)產(chǎn)生賦活促進(jìn)因子、cc3302和ssh10b，與野生型氧化亞鐵硫桿菌相比生長速度更快，同時(shí)耐鈾和耐熱能力有所提高，可以用于鈾礦浸出工業(yè)應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備具有表達(dá)能力的穿梭質(zhì)粒pJRD215-PT的方法，該方法操作簡單，能較好地解決用于氧化亞鐵硫桿菌接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒只具有克隆功能的問題。

本發(fā)明還提供一種三基因(rpf、cc3302和ssh10b)融合表達(dá)載體構(gòu)建的方法，使用柔性極高的兩段GGS鏈將這三段基因連接在一起與pJRD215-PT連接，降低了操作難度，且由于柔性GGS鏈的存在保證了各蛋白的正確折疊。

本發(fā)明還涉及氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株Acidi?thiobacillus?ferrooxidans?QEY-6(pJRD215-PT-rcs)在鈾礦浸出中的應(yīng)用，可以縮短浸鈾周期，提高浸出率，降低耗酸率。

本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之一是：穿梭表達(dá)載體pJRD215-PT構(gòu)建。

氧化亞鐵硫桿菌的轉(zhuǎn)化目前主要使用接合轉(zhuǎn)移方式，首先將構(gòu)建好的重組接合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化帶mob基因的感受態(tài)大腸桿菌(如S17-1和HB101等)，然后制備2∶2接合培養(yǎng)基，將帶重組接合質(zhì)粒的大腸桿菌和氧化亞鐵硫桿菌一起在接合培養(yǎng)基上孵育進(jìn)行接合反應(yīng)，收集細(xì)菌，轉(zhuǎn)至帶相應(yīng)抗生素的2∶2固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)增鑒定。但是目前應(yīng)用于氧化亞鐵硫桿菌的穿梭質(zhì)粒均為克隆載體，需要先用軟件預(yù)測(cè)目的基因的啟動(dòng)子，將目的基因與啟動(dòng)子一起擴(kuò)增后克隆入穿梭質(zhì)粒。這存在幾個(gè)問題，首先啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件對(duì)啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)不準(zhǔn)確，不同軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果相差較大；其次，做不同的基因均需要進(jìn)行預(yù)測(cè)，增加了工作量和難度。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種制備具有表達(dá)能力的穿梭質(zhì)粒pJRD215-PT的方法，該方法包括：擴(kuò)增引物合成，pJRD215和pQE30質(zhì)粒的提取，T5啟動(dòng)子和T0終止子的擴(kuò)增，目的基因片段的回收，測(cè)序鑒定。

(1)擴(kuò)增引物合成：根據(jù)Qiagen公司提供的pQE30質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)PCR寡核苷酸擴(kuò)增引物。T5啟動(dòng)子上游引物：GGCGTCGACCTCGAGAAATCATAAAAAAT(下劃線處為內(nèi)切酶SalI位點(diǎn))，下游引物：TATCTAGA?ACCCGGGGTACCGAGCTC(下劃線處為內(nèi)切酶XbaI位點(diǎn))。T0終止子上游引物：GTTCTAGATAATTAGCTGAGCTTGGACTC(下劃線處為內(nèi)切酶XbaI位點(diǎn))，下游引物：GGGAATTCATTCTCACCAATAAAAAACGCC(下劃線處為內(nèi)切酶EcoRI位點(diǎn))。

(2)pJRD215和pQE30質(zhì)粒的提取：平板劃線培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，集菌后按照全式金公司的EasyPure?Plasmid?MiniPrep?Kit的說明書提取質(zhì)粒。將提到的質(zhì)粒溶液儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>