[發明專利]一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910044070.6
• 申請日: 2009-08-10
• 公開（公告）號: CN101659962A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發明（設計）人: 丁德馨;李廣悅;王永東;劉劼;劉玉龍;胡南;王有團
• 申請（專利權）人: 南華大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C22B3/18;C22B60/02;C12R1/01
• 代理公司: 湖南省國防科學技術工業辦公室專利中心
• 代理人: 馮 青

1、一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法，其特征在于用pJRD215-PT載體在氧化亞鐵硫桿菌QEY-6中融合表達rpf、cc3302和ssh10b基因，包括：(1)氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-1(pJRD215-PT-rcs)的培養；(2)接合轉移；(3)陽性克隆篩選；該菌株為氧化亞鐵硫桿菌Acidithiobacillusferrooxidans?QEY-6(pJRD215-PT-rcs)，CCTCC?M?209156。

2、根據權利要求1所述的一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法，其特征在于該制備方法包括下列步驟：

A、pQE30的T5啟動子和T0終止子的擴增，并與pJRD215一起構建穿梭表達載體pJRD215-PT：以pQE30質粒為模板，根據T5啟動子、T0終止子和穿梭質粒pJRD215上的克隆位點設計引物，回收PCR片段與酶切后的pJRD215連接得到pJRD215-PT并轉化大腸桿菌JM109；

B、藤黃微球菌rpf基因、新月柄桿菌cc3302基因和芝田硫化葉菌ssh10b基因的擴增并克隆至T載體：根據藤黃微球菌rpf基因、新月柄桿菌cc3302基因和芝田硫化葉菌ssh10b基因和pJRD215-PT的酶切位點設計引物擴增片段，回收PCR產物，并分別克隆至pMD18-T載體，將這些重組載體分別轉化大腸桿菌JM109；

C、重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcs的構建：提取pMD18-T-rpf、pMD18-T-cc3302和pMD18-T-ssh10b，以pMD18-T-cc3302和pMD18-T-ssh10b為模板，擴增cc3302-ssh10b融合基因，回收擴增片段后與pMD18-T連接得到pMD18-T-cs，再以pMD18-T-cs和pMD18-T-rpf為模板擴增得到rpf-cc3302-ssh10b融合基因片段，并克隆于pMD18-T載體，最后亞克隆至pJRD215-PT載體得到pJRD215-PT-rcs，轉化至大腸桿菌S17-1；

D、融合表達rpf、cc3302和ssh10b基因的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株的構建：培養氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-1(pJRD215-PT-rcs)，用接合轉移的方法將pJRD215-PT-rcs轉入氧化亞鐵硫桿菌QEY-6，得到氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株Acidithiobacillus?ferrooxidans?QEY-6(pJRD215-PT-rcs)。