[發明專利]一種針對PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載體的構建及其應用

無效

• 申請號: 200910043271.4
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101575615A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 鄒望遠;郭曲練;宋宗斌;張重;劉暢;趙媛
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A61K48/00;A61P29/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所
• 代理人: 顏 勇

1.一種針對PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載體，是自身失活的第三代慢病毒載體SIN，其特征在于，所述的載體SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh?PKCγ重組載體，所述的pGCSIL-GFP/U6-Sh?PKCγ重組載體是在pGCSIL-GFP載體的MCS中連接了針對ShRNA的雙鏈DNA片段；所述的雙鏈DNA片段的序列如下：

PSCSI625：

5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’。

2.權利要求1所述的針對PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，根據PKCγmRNA序列，設計合成了針對ShRNA的雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段的序列如下：

PSCSI625：

正義鏈：5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

反義鏈：3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’

然后將所述的DNA片段連接到pGCSIL-GFP載體的MCS中構建成pGCSIL-GFP/U6-ShPKCγ重組載體；再將pGCSIL-GFP/U6-Sh?PKCγ重組載體、具有圖2所示結構的pHelper1.0、圖3所示結構的pHelper?2.0三種載體共轉染293T細胞培養，獲得所述的重組慢病毒載體。

3.根據權利要求2所述的針對PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，在所述的DNA片段末端引入AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

4.根據權利要求2所述的針對PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，用AgeI和EcoRI酶將pGCSIL-GFP載體酶切，回收大片段，將所述的大片段與DNA片段用T4?DNA連接酶連接后轉化感受態菌DH5α，挑取重組陽性克隆。

5.權利要求1所述的針對PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載體的應用，其特征在于，所述的重組慢病毒載體用于制備治療慢性神經病理性疼痛的制劑。