[發明專利]一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG及其制備

無效

• 申請號: 200910042835.2
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101544989A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 劉選明;王宏歸;劉萍;林辰濤
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所
• 代理人: 顏 勇

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒：pElrLCG及其制備方法。

背景技術

現有的可以用來拯救植物胚胎致死突變的誘導型載體有：(1)四環素誘導型載體(2)糖皮質激素誘導型載體(3)雌激素誘導型載體(4)酒精誘導型(5)蛻皮(Ecdysone)激素誘導型載體(6)銅誘導型載體等。四環素誘導性載體的使用對環境存在潛在的危險，另外細胞核中必須存在大量四環素才能起作用，而高濃度的四環素是有毒的；雌激素誘導型載體的缺點是：局部誘導性強，雌激素在植物體內不易擴散，所以不能對植物進行整株誘導；蛻皮激素誘導型載體主要的缺點是：葉片對蛻皮激素吸收差；而酒精誘導型載體對植物有毒害作用，另外酒精易揮發；銅誘導型表達載體的缺點是：銅只能在部分細胞起作用，對植物有毒害作用；糖皮質激素誘導型表達載體的誘導化學物質：地塞米松，可以高效地被運輸到植物的各個組織器官而且對植物無毒害作用，這正是本載體的優點。本載體將GR-Cre重組酶片段構建在兩個同向loxP重組位點之間，這兩個loxP位于T-DNA之上，目前的報道大部分都是將Cre重組酶片段和loxP位點分別構建在兩個Ti質粒的T-DNA上，轉基因植株通過雜交實現重組。如果將GR-Cre重組酶片段和loxP位點同時構建在同一個載體上，那么可以人為控制重組的發生和終止，這樣既可以節省時間也可以減少工作量。Cre重組酶是38道爾頓的DNA特異位點重組酶，是從噬菌體P1分離出來的，loxP(locusofcrossover?in?P1)最早在噬菌體P1的基因組里發現的，loxP位點具有34個堿基，在兩端有13個反向重復的堿基，中間核心序列是8個非回文結構的堿基，它決定了loxP位點的極性，Cre重組酶分別結合在loxP位點的兩端，在中間核心序列區將loxP切開(見圖3)。

如果兩個loxP位點是同向的，那么在重組酶的作用下將兩個loxP切開從而產生4個粘性末端，兩個loxP位點之間的序列通過兩端的粘性末端自我連接成環，從基因組里游離出來丟失掉(見圖4)。

由于Cre重組酶只能在細胞核內起作用，Cre連上GR后，GR-Cre在沒有施加地塞米松時，GR結合在內質網上，這時GR-Cre只存在于細胞質中，因此不能使Loxp位點發生重組；噴施地塞米松時，地塞米松與GR結合使得GR-Cre從內質網上釋放出來，Cre重組酶進入核內，結合到Loxp位點上引發重組。在Loxp位點之間還含有一個Gateway?cassette和多克隆位點(MCS)，Gateway克隆技術的優點是不受酶切位點的限制，本載體的Gatewaycassette含有attR1和attR2兩個重組位點，可以通過LR反應克隆不同的啟動子，多克隆位點位于Gateway?cassette的后面，可以將目的基因克隆到多克隆位點(MCS)上。

發明內容

本發明的目的在于提供一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒：pElrLCG及其制備的方法。讓胚胎致死突變體在胚胎時期不致死，從而可以研究胚胎致死突變體后期的發育狀況，同時又可以在渡過胚胎時期后的任意一個時期，在地塞米松誘導下Cre重組酶入核引發loxP位點重組，將兩個loxP位點之間基因從植物基因組里敲除掉。

本發明的目的是通過以下方式實現的。

一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG是由原始載體pJawoh18-RNAi用XhoI-SpeI雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI連接而成。在所述的合成片段的NheI和NcoI酶切位點之間接入了GR—Cre片段，在所述的合成片段的BsiwI和KpnI酶切位點之間接入了Gateway?cassette片段。

所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的制備方法是將原始載體pJawoh18-RNAi用XhoI-SpeI雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI連接構建質粒載體pElrL，然后在合成片段的NheI和NcoI酶切位點之間接入GR—Cre片段構建質粒載體pElrLC，最后在合成片段的BsiwI和KpnI酶切位點之間接入Gatewaycassette片段構建所述的質粒載體pElrLCG。