[發明專利]一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG及其制備

無效

• 申請號: 200910042835.2
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101544989A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 劉選明;王宏歸;劉萍;林辰濤
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所
• 代理人: 顏 勇

1、一種拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG，其特征在于，所述的載體pElrLCG是由原始載體pJawoh18-RNAi用XhoI-SpeI雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI連接而成，在所述的合成片段的NheI和NcoI酶切位點之間接入了GR—Cre片段，在所述的合成片段的BsiwI和KpnI酶切位點之間接入了Gatewaycassette片段。

2、權利要求1所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的制備方法，其特征在于，將原始載體pJawoh18-RNAi用XhoI-SpeI雙酶切消化回收的5.211kb長的載體片段與合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI連接構建質粒載體pElrL，然后在合成片段的NheI和NcoI酶切位點之間接入GR—Cre片段構建質粒載體pElrLC，最后在合成片段的BsiwI和KpnI酶切位點之間接入Gateway?cassette片段構建所述的質粒載體pElrLCG。

3、根據權利要求2所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的制備方法，其特征在于，所述的質粒載體pElrL的構建過程為：XhoI-SpeI雙酶切載體pUC57-loxP消化，回收得到合成片段XhoI—loxP—NheI—NcoI—Nos—BsiwI—KpnI—StuI—BgIII—MfeI—AatII—1xMyc—loxP—SpeI，然后合成片段與經XhoI-SpeI雙酶切載體pJawoh18-RNAi消化回收后的5.211kb的片段連接即成。

4、根據權利要求2或3所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的制備方法，其特征在于，所述的質粒載體pElrLC的制備過程為：用正向引物：CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC和反向引物：CGGCCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT以質粒pCre為模板PCR擴增GR-Cre片段，然后用NheI—NcoI酶分別將擴增出的GR-Cre片段和質粒pElrL進行雙酶切，最后將酶切后的GR-Cre片段與酶切后的pElrL質粒長片段連接即成。

5、根據權利要求4所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的制備方法，其特征在于，所述的pElrLCG質粒載體的制備過程為：用正向引物：CGGCGTACGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG和反向引物：CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAA以質粒載體pJawoh18-RNAi為模板PCR擴增Gateway?cassette片段，然后用BsiwI酶在55℃分別對Gateway?cassette片段和質粒pElrLC進行酶切，再用KpnI酶在37℃分別對BsiwI酶切過的Gateway?cassette片段和pElrLC酶切回收產物進行酶切，最后用T4連接酶將酶切過的Gateway?cassette片段與酶切過的pElrLC質粒載體長片段連接即成。

6、根據權利要求5所述的拯救植物胚胎致死突變的新型Ti質粒pElrLCG的制備方法，其特征在于，所述的Gateway?cassette片段含有attR1?attR2。