[發(fā)明專利]一種用于mtDNA等位基因分型及點突變檢測的ARMS-PCR方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910042411.6
• 申請日: 2009-01-05
• 公開（公告）號: CN101768635A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 朱敏;胡維新;周鋼;黃河
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中南大學專利中心 43200
• 代理人: 胡奕

技術領域

本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，尤其涉及線粒體DNA(mitochondrial?DNA， mtDNA)多態(tài)性基因型鑒定及點突變檢測方法。

背景技術

為了解mtDNA突變或多態(tài)性與疾病關聯(lián)而進行的病例對照研究中，往往 涉及對大量個體的多態(tài)性基因型進行區(qū)別鑒定；mtDNA相關疾病的分子診斷、 遺傳咨詢和用藥指導等服務，也都需要快速、簡便、有效的突變分析或基因 分型方法。

限制性酶類方法如限制性片段長度多態(tài)性(restriction?fragment?length polymorphisms，RFLPs)分析是當前進行mtDNA點突變或mtDNA單個位點 核苷酸多態(tài)性(mitochondrial?DNA?single?nucleotide?polymorphisms，mtSNPs) 檢測的主要方法，如mt4833A/G置換多態(tài)可通過Hae?II、mt5178C/A經(jīng)Alu?I、 mt10398A/G經(jīng)Bgl?I及mt15497G/A經(jīng)Dde?I等不同限制性酶識別序列獲得 鑒定；但該方法僅適用于待檢多態(tài)性或突變位點附近存在適當?shù)奶囟ㄏ拗菩? 內(nèi)切酶酶切識別序列的情況。

此外，由于mtDNA分子較小(16，569bp)，隨著DNA測序技術不斷進 步同時成本不斷下降，mtDNA全長或部分(如編碼區(qū))序列分析也成為mtDNA 多態(tài)性和基因突變分析的常用方法，但這不僅需要特定的測序試劑盒和自動 測序儀及檢測設備等，還需要從長的測序結果中比對確定靶位點核苷酸，因 此對于mtDNA單個位點特定多態(tài)性的明確而言，這是一個消耗大量成本和工 作量而僅獲得非直接結果的不經(jīng)濟的方法。

擴增難熔突變系統(tǒng)(amplification?refractory?mutation?system，ARMS)或 稱等位(基因)特異性擴增(allele-specific?amplification，ASA)是驗證性檢 測DNA序列變化的經(jīng)典方法之一。ARMS-PCR基因分型檢測通常包括兩個 互補的PCR反應，使用相同的DNA模板和一條相同的共有引物及其他條件， 區(qū)別僅在于與共有引物配對的ARMS引物不同，一條3’末端與給定位點上 的一種特定核苷酸互補，與另一種則為錯配，反之另一條引物亦如此。因而 兩個反應只能選擇性擴增特定的DNA模板，即只有ARMS引物完全退火結 合的反應可順利進行，而3’末端不匹配引物的延伸受到阻滯。雖然在原理上 ARMS-PCR只要針對核苷酸可變(基因突變或多態(tài)性)位點進行特異性錯配引 物設計即可，但由于mtDNA分子大小及結構復雜度遠較核基因組DNA小， 且在細胞內(nèi)呈多拷貝，導致其模板效用性遠較核DNA高，致使常規(guī)使用的僅 3’末端堿基(核苷酸)錯配的ARMS引物不足以形成對相同模板的擴增效率 差異，因此，現(xiàn)有技術領域中沒有將ARMS-PCR用于mtDNA突變或mtSNPs 檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有mtDNA基因型多態(tài)性分析方法的不足，針對 mtDNA模板效用性較核基因組DNA高而不易形成錯配引物間PCR擴增效率 差異的特點，提出一種優(yōu)化改進的ARMS-PCR方法用于mtDNA點突變檢測 或mtSNPs多態(tài)性基因型鑒定。

本發(fā)明檢測mtDNA點突變或mtSNPs多態(tài)性基因型的ARMS-PCR方法 的詳細技術方案為：針對mtDNA突變或多態(tài)性待測位點，設計特異性ARMS 適配引物，使引物3’末端終止在待診位點，同時在ARMS引物(位于上游 或下游均可)3’端倒數(shù)3-4位增加設置兩個連續(xù)的堿基錯配，錯配方式為A-T 或G-C的互換；但ARMS-PCR擴增反應中增加模板mtDNA的用量為常規(guī)PCR 擴增mtDNA的2～10倍，如20～100ng總基因組DNA(其中包含mtDNA) /25uLPCR反應體系；PCR擴增獲得包含靶位點的一段mtDNA片段，最后通 過瓊脂糖凝膠電泳加以檢測，根據(jù)陽性反應確定待檢基因型。

對于mtDNA而言，其中存在大量密集排布的多態(tài)性位點，所選擇設計的 錯配ARMS引物中不應再包含其他潛在的不匹配核苷酸，因此本發(fā)明中，通 過選擇錯配引物的位置在上游或者在下游，可以盡量避開其他潛在的多態(tài)性 位點，從而避免可能的假陰性PCR擴增結果，這使得該方法的模板適用范圍 得以擴大。