[發明專利]牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法

有效

• 申請號: 200910041985.1
• 申請日: 2009-08-20
• 公開（公告）號: CN101633948A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 劉冬梅;余以剛;梁潔英;吳暉;吳祖星;陳子劍;李曉鳳;唐語謙
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/07
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 李衛東

技術領域

本發明涉及抗生素殘留檢測，具體是指牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法。

背景技術

在奶牛養殖業中β-內酰胺環類的抗生素常用于醫治奶牛的乳腺炎，尤其是青霉素G由于其廣譜并廉價因此被大量地使用，因此導致了牛奶中含有高濃度的殘留。且青霉素類還會使一些個體產生十分劇烈的過敏反應。如果長期攝入含有該類抗生素的牛奶會使人體腸道內正常菌群受到抑制并使人產生抗藥性。許多國家對牛奶中的β-內酰胺類藥物尤其是青霉素G殘留的管理十分嚴格，世界衛生組織推薦的青霉素G在牛奶中的限量由1976年的0.05μg/ml(50ppb)提高到目前的0.004μg/ml(4ppb)，美國為0.005μg/ml(5ppb)。目前按國家標準GB4789.27-2003鮮乳中抗生素殘留量檢測方法進行檢測，檢測限僅為0.04μg/ml(40ppb)，該法靈敏度低，與歐美國家檢測方法差一個數量級，已不適應國際需要。

中國發明專利200410019478.5(CN?1584046A)公開“檢測牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑制備方法及其應用”，該方法的檢驗時間長約需要5小時左右，用的菌株是嗜熱乳酸鏈球菌，發酵溫度為40～45℃。王志強等人“微生物抑制法快速檢測鮮奶中多種抗生素殘留”(中國食品衛生雜志，2008，20(2)：139-141)沒有制成試劑盒，檢測時間長達24h以上，操作步驟復雜。

上述的檢測方法都是采用微生物檢測法，普遍存在由于檢測活菌量低(10⁵～10⁶cfu/ml)且熱穩定性差，靈敏度低，檢測時間長，沒有制成試劑盒，使得檢測操作繁瑣，無法進行標準化檢測。而酶聯免疫檢測法和放射免疫分析法(也叫Charm?II)需要昂貴的檢測儀器，費用高，每個樣品的檢測成本為100～300元，不適合乳品企業的低成本的檢測需要。牛奶中抗生素殘留的檢測不僅僅涉及到乳品企業的經濟效益，更大地涉及到人類健康的公共衛生問題，因此，為了提高牛奶的安全性，開發低成本、高通量、快速檢測和靈敏度高的檢測試劑盒勢在必行。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種低成本、高通量、檢測速度快和靈敏度高的牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法。

本發明利用嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus?Stearothermophilus)對β-內酰胺類抗生素敏感的特點，檢測β-內酰胺類抗生素的殘留。首先將嗜熱脂肪芽孢桿菌進行高密度培養，然后濃縮菌體，與培養基、指示劑和反應助劑在高溫條件下灌注，制成凝固的試劑盒。被檢奶樣中可能存在的抗生素小分子向培養基內擴散，而樣品中干擾芽孢繁殖的其它大分子被隔離在瓊脂培養基的表層。當含有檢出限以上濃度的β-內酰胺類抗生素時，嗜熱脂肪芽孢桿菌的生長被抑制，培養基保持原有色澤(藍色)，為陽性；當無抗生素或抗生素含量很低時，嗜熱脂肪芽孢桿菌就會生長繁殖利用培養基里的營養物質產酸，使指示劑變色(黃色)，為陰性。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，包括如下步驟和工藝條件：

第一步將嗜熱脂肪芽孢桿菌凍干粉置于肉湯液體培養基，于45～55℃，100～150rpm下培養24～36h，制成母發酵劑；以重量份數計，所述肉湯培養基原料配方為：蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化鈉0.4～0.6份，蒸餾水94.4～96.1份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至45～55℃備用；

第二步以體積比為2～5∶100的比例，將母發酵劑接入生產培養基中，于50～65℃的發酵罐中進行培養，在培養過程用NaOH溶液調整pH為7.0～8.0，攪拌轉速為100～150rpm，培養24h～36h后收集，得發酵菌懸液；以重量份數計，所述生產培養基原料配方組成為：蛋白胨1.5～3.0份，牛肉膏為2.5～3.5份，葡萄糖為1.0～2.0份，磷酸氫二鉀0.010～0.030份，氯化鈉0.4～0.6份，蒸餾水91.37～93.59份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至50～65℃備用；

第三步將所述發酵菌懸液于5000～8000rpm條件下，離心20～25min，舍棄上清液，收集菌泥A；