[發明專利]牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法

有效

• 申請號: 200910041985.1
• 申請日: 2009-08-20
• 公開（公告）號: CN101633948A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 劉冬梅;余以剛;梁潔英;吳暉;吳祖星;陳子劍;李曉鳳;唐語謙
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/07
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 李衛東

1.一種牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件：

第一步將嗜熱脂肪芽孢桿菌凍干粉置于肉湯液體培養基，于45～55℃，100～150rpm下培養24～36h，制成母發酵劑；以重量份數計，所述肉湯培養基原料配方為：蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化鈉0.4～0.6份，蒸餾水94.4～96.1份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至45～55℃備用；

第二步以體積比為2～5∶100的比例，將母發酵劑接入生產培養基中，于50～65℃的發酵罐中進行培養，在培養過程用NaOH溶液調整pH為7.0～8.0，攪拌轉速為100～150rpm，培養24h～36h后收集，得發酵菌懸液；以重量份數計，所述生產培養基原料配方組成為：蛋白胨1.5～3.0份，牛肉膏為2.5～3.5份，葡萄糖為1.0～2.0份，磷酸氫二鉀0.010～0.030份，氯化鈉0.4～0.6份，蒸餾水91.37～93.59份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至50～65℃備用；

第三步將所述發酵菌懸液于5000～8000rpm條件下，離心20～25min，舍棄上清液，收集菌泥A；

第四步在菌泥A中，按生理鹽水與菌泥的體積比為1～5∶1加入生理鹽水，混合均勻后于5000～8000rpm條件下，離心20～25min，舍棄上清液，收集菌泥；清洗2～3次，于5000～8000rpm條件下，離心20～25min，舍棄上清液，收集菌泥，放置4～10℃條件下48～120h，得菌泥B；

第五步按瓊脂指示劑溶液與所述菌泥B的體積比為1～5∶1加入瓊脂指示劑溶液，于60～70℃下混合均勻，得反應液，將所述反應液0.1～0.3mL分別裝入孔板的每一孔或微量反應器中，每孔或微量反應器中的芽孢菌達到1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu，蓋上鋁塑膜并進行熱合封口，于60～70℃倒置0.5h后，順置冷卻至常溫，并裝入鋁塑袋，防潮和避光保存，制成檢測試劑盒；以重量份數計，所述瓊脂指示劑溶液原料配方組成為：瓊脂1.5～3.0份，溴甲酚紫0.0008～0.0015份，NaOH?0.015～0.020份，蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化鈉0.4～0.6份，蒸餾水91.38～94.58份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至60～70℃備用；所述每孔或微量反應器中的反應液配方組成為：瓊脂1.5～15.0mg，溴甲酚紫0.8～7.5μg，NaOH?15～100μg，蛋白胨1.0～7.5mg，牛肉膏粉2.5～17.5mg，氯化鈉0.4～3.0mg，蒸餾水94.38～472.90mg，芽孢菌數為1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu；

第六步在所述第五步的試劑盒每孔或微量反應器中加入牛奶樣品0.05～0.25mL，用鋁塑膜仔細密封，于60～65℃的水浴或恒溫箱中恒溫反應2小時15分～2小時45分，陰性樣品的試劑盒每孔或微量反應器中由藍色變成黃色，變色范圍pH為5.2～6.8，表示抗生素殘留呈陰性；陽性樣品不變色，表示抗生素殘留呈陽性。

2.根據權利要求1所述的牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，其特征在于：第二步母發酵劑與生產培養基的體積比為3～4∶100。

3.根據權利要求1所述的牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，其特征在于：所述第二步中NaOH溶液的濃度為1～2mol/L。

4.根據權利要求1所述的牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，其特征在于：所述第一步的培養溫度為50℃，培養24h。

5.根據權利要求1所述的牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，其特征在于：所述第二步的培養溫度為55℃，培養24h。

6.根據權利要求1所述的牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法，其特征在于：所述第五步瓊脂指示劑溶液與菌泥B的體積比為4-5∶1。