[發(fā)明專利]基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的甲型肝炎病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910041358.8
• 申請日: 2009-07-24
• 公開（公告）號: CN101660005A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹以誠;黃逸男;李志勇;杜正平;陳洵;譚惠媚;王志強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 陳 衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的甲型肝炎病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

目前對甲型肝炎病毒有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒定、形態(tài)學(xué)鑒定和血清學(xué)鑒定為主的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T?18936-2003)，到特異蛋白的免疫學(xué)檢測技術(shù)、核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)等分子生物學(xué)檢測方法(GB/T?22287-2008)。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準(zhǔn)確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等微生物學(xué)檢測舊模式，不需要對微生物進(jìn)行分離提純，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測，并且與分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)手段相結(jié)合，向準(zhǔn)確、快速、靈敏和自動化的方向發(fā)展。

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real?time?PCR)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫?cái)U(kuò)增(Isothermal?Amplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性，且目前也未見有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)核分歧桿菌的基因快速診斷試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測成本低、使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的甲型肝炎病毒基因快速診斷試劑盒，該試劑盒是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來檢測甲型肝炎病毒的。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述甲型肝炎病毒基因快速診斷試劑盒的檢測方法。

本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一、本發(fā)明的甲型肝炎病毒基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、Bst?DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中，其中：

所述兩對引物為：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；

其中，Y代表C或T；

上述反應(yīng)液含有1.6～2mmol/L?dNTP、20～25mmol/L?Tris-HCl、10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L。優(yōu)選的比例是：反應(yīng)液含有2mmol/L?dNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125％TritonX-100、1mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。(0.1～0.125％TritonX-100是：Triton?X-100占反應(yīng)液的體積百分比為0.1～0.125％)

上述逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。

上述陽性對照為攜帶甲型肝炎病毒基因的質(zhì)粒DNA。

上述顯色液優(yōu)選為SYBR?Green?I或EvaGreen。

上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。

二、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝

1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；

2、將反應(yīng)液無菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；

3、將穩(wěn)定液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；

4、將逆轉(zhuǎn)錄酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；

5、將RNA酶抑制劑無菌分裝，抽樣質(zhì)檢；

6、將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；

7、組裝試劑盒。