[發明專利]一種用于防治肝硬化的人源細胞珠蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 200910040558.1
• 申請日: 2009-06-25
• 公開（公告）號: CN101580846A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 魏威;董文其
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C07K14/435;C12P21/02;A61P1/16;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所
• 代理人: 胡濟元

1、一種人源細胞珠蛋白的表達質粒，該質粒是將SEQ?NO.1所示的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到載體pET-32a的表達區得到。

2、權利要求1所述的一種人源細胞珠蛋白的表達質粒的制備方法，該方法由以下步驟組成：

(1)提取Hep?G2細胞的總RNA，用引物1和引物2進行反轉錄PCR得到序列為SEQ?NO.2的DNA片段；

(2)以序列為SEQ?NO.2的DNA片段為模板用引物2和引物4進行PCR反應得到序列為SEQ?NO.3的DNA片段；

(3)以序列為SEQ?NO.3的DNA片段為模板用引物3和4進行PCR反應得到序列為SEQNO.1的DNA片段；

(4)序列為SEQ?NO.1的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到載體pET-32a的表達區，得到重組質粒pET-32a-hCygb；

所述引物1的序列為5’-CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3’；

所述引物2的序列為5’-TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3’；

所述引物3的序列為5’-GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3’；

所述引物4的序列為5’-GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3’。

3、一種轉化體，其特征在于該轉化體的宿主為大腸桿菌BL21(DE3)，導入的重組載體為權利要求1所述的人源細胞珠蛋白的表達質粒。

4、一種重組人源細胞珠蛋白，該蛋白由權利要求3所述的轉化體在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的誘導培養下的表達產物經凝血因子FXa切割去除Trx標簽、His標簽和FXa識別序列后獲得，其中所述的表達產物是由Trx標簽、His標簽、FXa識別序列和人源細胞珠蛋白依次連接構成的融合蛋白。

5、權利要求4所述的一種重組人源細胞珠蛋白的制備方法，該方法由以下步驟組成：

(1)將權利要求3所述轉化體在含異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培養基中誘導培養；

(2)收集菌體，將菌體破碎，取上清，用組氨酸標記親和層析柱分離出融合蛋白；

(3)所得融合蛋白用凝血因子FXa酶切，然后上組氨酸標記親和層析柱，用氯化鈉溶液按1～99％(w/v)的梯度洗脫，收集出現第一個洗脫峰的洗脫液，最后用pH值為8.0、濃度為10mM的Tris-HCl緩沖液透析，濃縮即可。