[發(fā)明專利]一種L-精氨酸的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910040485.6
• 申請日: 2009-06-23
• 公開（公告）號: CN101586130A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張?zhí)碓?/a>;徐達;雷劍芬;鄭明英;寧異真;陸林芳
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P13/10
• 分類號: C12P13/10;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司
• 代理人: 羅曉林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種L-精氨酸的制備方法，尤其涉及一種通過基因重組技術(shù)改進大腸桿菌積累精氨酸的能力，并利用改進的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的方法。

背景技術(shù)

L-精氨酸是生物代謝途徑中一種重要的氨基酸，也是一種工業(yè)上用途廣泛的氨基酸，可用于食品及制藥等行業(yè)，生產(chǎn)氨基酸注射液、保肝護肝劑等，有防提高人體免疫力、防治心血管疾病等作用，并有可能是治療腫瘤的一種潛在藥物成分。

L-精氨酸發(fā)酵生產(chǎn)所用的菌種主要有谷氨酸棒桿菌、黃色棒桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌等。這些菌種一般通過篩選抗精氨酸類似物的菌種以及誘變得到，也有些使用抗其它藥物的突變體或基因重組技術(shù)改造的菌株。

細菌的精氨酸生物合成途徑是由L-谷氨酸開始，經(jīng)過八步酶催化反應最終生成L-精氨酸。精氨酸合成途徑的酶一般都是受到嚴格調(diào)控的，酶基因的轉(zhuǎn)錄會受到精氨酸或精氨酸與阻遏物復合物的阻遏，酶蛋白的催化活性也會受到精氨酸的反饋抑制。

基因工程改造菌種多采用大腸桿菌，其中一般是在重組的大腸桿菌中引入一種編碼細菌精氨酸生物合成途徑的酶的基因以提高某種酶的活性，或者引入經(jīng)過人工突變的酶基因，其中酶與精氨酸結(jié)合的位點得到改變，使精氨酸的抑制作用減弱或消除，從而大腸桿菌積累L-精氨酸的能力得到提高。

在細菌的代謝過程中，合成途徑的各步的酶通常都會受到精氨酸的不同程度的反饋抑制。在大腸桿菌中，精氨酸抑制其合成途徑的關(guān)鍵酶是第一步的乙酰谷氨酸合成酶，它同時受精氨酸阻遏表達及活性抑制，其余各步的酶受精氨酸的抑制作用較小。

在谷氨酸棒桿菌中，精氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶是第二步的乙酰谷氨酸激酶，它受到精氨酸的阻遏和抑制。而在谷氨酸棒桿菌中第一步的乙酰谷氨酸合成酶和第五步的鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶實際上是由同一個酶完成的，它基本上不受阻遏也不受抑制。

在細菌中還普遍存在一個精氨酸操縱子的調(diào)節(jié)基因argR，在不同的細菌中有不同的功能，在大腸桿菌中，argR是一個負調(diào)控基因，它會抑制細胞中精氨酸的合成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種耗時短、安全可靠、環(huán)保型、過程簡單、產(chǎn)量高的L-精氨酸的制備方法。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明通過對大腸桿菌進行基因重組改性，敲除了大腸桿菌中的argR基因，改性后的大腸桿菌能大量發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸。所述大腸桿菌的改性方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達載體：

(2)將含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

在上述制備方法中，所述改性大腸桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)選是：在通氣條件下培養(yǎng)16-72小時，pH值控制在6.5-7.5，溫度30-37℃。

在上述制備方法中，步驟(1)具體包括如下步驟：

利用聚合酶鏈反應PCR的方法，以谷氨酸棒桿菌DNA為模板，擴增乙酰谷氨酸合成酶基因，PCR用的上游引物：CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAC(SEQ?NO：1)，其中5’端加入了NdeI限制酶切位點；下游引物：CTAGGATCCTTAAGTGCTGTACGCGGAGT(SEQ?NO：2)，其中5’端加入了BamHI限制酶切位點；PCR條件：94℃30秒；60℃30秒；72℃90秒；擴增30個循環(huán)，得到乙酰谷氨酸合成酶基因；

將乙酰谷氨酸合成酶基因用NdeI和BamHI雙酶切，與用同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-9a連接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達載體，稱為pET-argJ。

在上述制備方法中，步驟(2)具體包括如下步驟：

選取表達載體pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作為選擇標記，將乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大腸桿菌基因組中的重組單元；

PCR上游引物序列為(SEQ?NO：3)：

GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAAGGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAAATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG；

PCR下游引物序列為(SEQ?NO：4)：

TGGCAGGCAGTAAACCATTTCCATTTTGGCATTGCGTGTACGTACAGCACCAAACTTGGTCAACATCCGCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG；