[發(fā)明專利]一種L-精氨酸的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910040485.6
• 申請(qǐng)日: 2009-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN101586130A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)碓?/a>;徐達(dá);雷劍芬;鄭明英;寧異真;陸林芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P13/10
• 分類號(hào): C12P13/10;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 羅曉林

1、一種L-精氨酸的制備方法，其特征是培養(yǎng)經(jīng)過改性的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，所述大腸桿菌的改性方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體：

(2)將含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

2、如權(quán)利要求1所述的L-精氨酸的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件是：在通氣條件下培養(yǎng)16-72小時(shí)，pH值控制在6.5-7.5，溫度30-37℃。

3、如權(quán)利要求1所述的L-精氨酸的制備方法，其特征在于步驟(1)包括如下步驟：

利用PCR的方法，以谷氨酸棒桿菌DNA為模板，擴(kuò)增乙酰谷氨酸合成酶基因，PCR用的上游引物：CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAC，其中5’端加入了NdeI限制酶切位點(diǎn)；下游引物：CTAGGATCCTTAAGTGCTGTACGCGGAGT，其中5’端加入了BamHI限制酶切位點(diǎn)；PCR條件：94℃30秒；60℃30秒；72℃90秒；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，得到乙酰谷氨酸合成酶基因；

將乙酰谷氨酸合成酶基因用NdeI和BamHI雙酶切，與用同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pET-9a連接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表達(dá)載體，稱為pET-argJ。

4、如權(quán)利要求1所述的L-精氨酸的制備方法，其特征在于步驟(2)包括如下步驟：

選取表達(dá)載體pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記，將乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大腸桿菌基因組中的重組單元；

PCR上游引物序列為：

GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAAGGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAAATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG；

PCR下游引物序列為：

TGGCAGGCAGTAAACCATTTCCATTTTGGCATTGCGTGTACGTACAGCACCAAACTTGGTCAACATCCGCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG；

以表達(dá)載體pET-argJ為模板，用以上兩條序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：94℃30秒；72℃4分鐘；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，得到兩端帶有argR基因同源重組序列、包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因的重組單元；

將重組單元導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；

篩選重組單元插入到大腸桿菌argR基因位點(diǎn)的陽性轉(zhuǎn)化子。