[發明專利]動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200910040394.2
• 申請日: 2009-06-19
• 公開（公告）號: CN101586161A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 朱興全;林瑞慶;唐劍棟;宋慧群;鄧艷;袁子國
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳 衛

技術領域

本發明涉及動物華支睪吸蟲病的基因學鑒定，特別是涉及動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術

華支睪吸蟲病是由后睪科支睪屬的華支睪吸蟲(Clonorchis?sinensis)寄生于犬、貓、豬等動物及人膽管內所引起的一種重要的人獸共患寄生蟲病，俗稱肝吸蟲病。

華支睪吸蟲寄生在淡水螺、淡水魚、淡水蝦、犬、豬、牛、鼠、家兔、豚鼠、狐貍和家禽等動物，人為終末宿主，本病可使肝臟腫大并導致其他肝病變，病情多呈慢性經過，臨床上可見精神沉郁，食欲減退和下痢等癥狀，重者可致肝硬化甚至癌變，少數兒童和青少年患者可致侏儒癥，并發癥多達21種，對人類健康的影響不容忽視。

華支睪吸蟲病呈地方性流行，在東南亞國家較常見，該病在我國已有很長的歷史，流行廣泛，目前華支睪吸蟲病有逐年上升的趨勢，其發生和流行除了跟人們的一些不良飲食習慣如生食魚蝦等有關系外，其中間宿主(淡水螺、淡水蝦等)以及保蟲宿主(保蟲宿主有貓、犬、豬、牛、鼠、狐貍和家禽等動物)在其流行過程中是十分重要和關鍵的環節。

分子生物學方法已開始應用于華支睪吸蟲的分子鑒定上。PCR以其高度的特異性和敏感性，已廣泛應用于分子生物學研究的各個領域，尤其對各種病原體的檢測和疾病的診斷中。目前，在寄生蟲學領域，用于疾病診斷和蟲體檢測的PCR方法很多，如常規PCR、反轉錄PCR、套式PCR、免疫磁性捕獲PCR、熒光定量PCR(FQ-PCR)等。

Le(Le?TH，Van?De?N，Blair?D，et?al.Clonorchis?sinensis?and?Opisthorchisviverrini：development?of?a?mitochondrial-based?multiplex?PCR?for?theiridentification?and?discrimination.Exp?Parasitol.2006，112(2)：109-14)通過設計兩對線粒體DNA引物，用多重PCR方法成功對華支睪吸蟲和麝貓后睪吸蟲進行鑒別診斷，能檢測到最低樣品DNA量為0.78ng；Parvathi等(Parvathi?A，JieyuanL，Iddya?K，et?al.Clonorchis?sinensis：Development?and?evaluation?of?a?nestedpolymerase?chain?reaction(PCR)assay.Exp?Parasitol，2007，115(3)：291-295)首先對華支睪吸蟲的基因組用隨機引物進行擴增測序，選擇合適的部位設計兩對引物進行巢式PCR，結果表明，該方法具有很好的敏感性和特異性，能檢測到魚肉中最低華支睪吸蟲囊蚴的DNA為10^-5ng，有望在華支睪吸蟲魚的流行情況調查以及動物的糞便檢查中得到應用。

人體華支睪吸蟲病診斷技術的研究一直是醫學研究中的一個熱點，已建立了多種診斷檢測方法，包括蟲卵檢查、皮內試驗(IT)、B超、CT、間接血凝免疫吸附試驗(ELISA)、單克隆抗體ELISA(McAb-ELISA)以及免疫膠體金方法等，但在獸醫領域，均未見應用于動物華支睪吸蟲病的診斷，目前動物華支睪吸蟲病主要還是依靠糞檢患畜蟲卵的方法進行流行病學調查，因為此種方法敏感性不高，極易漏檢，也易誤診。

從糞便中提取DNA一直是個難點，糞便的成分復雜，含有各種各樣抑制PCR的物質，如膽鹽、多糖等。目前能從糞便中提取DNA的方法要么就是需要繁瑣的步驟，如免疫磁性分離法、梯度離心法、熒光激活細胞分選術等，要么就是需要用到昂貴的DNA提取試劑盒。如能用快速、簡便的方法從糞便中提取到寄生蟲的DNA，將會有重大的意義，能對疾病進行及早的診斷，預防疾病的發生。

PCR檢測方法敏感性高、一次檢測大量樣品、避免主觀偏差等優越性預示著它在特異性診斷、流行病學調查和藥物治療監控等方面有著廣闊的應用前景。

內轉錄間隔區(Internal?Transcribed?Spacer，ITS)是核糖體DNA中介于18S和28S之間的內轉錄間隔區，包括第一、第二內轉錄間隔區(ITS-1和ITS-2)兩段序列，ITS序列存在于高度重復的核糖體中，進化速度快且長度不大，加上協同進化使該片段在基因組不同單元間十分一致，因而十分適合進行各種分子操作。

發明內容