[發明專利]草魚細菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯滅活疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 200910039862.4
• 申請日: 2009-05-31
• 公開（公告）號: CN101574516A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 白岳強;許淑英;江小燕;鄧國成;羅霞;黃志斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61K39/02;A61P31/04;C12N1/20;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所
• 代理人: 陳雅平

技術領域

本發明屬于微生物工程領域，涉及預防草魚細菌性爛鰓病、敗血病、赤皮病的疫苗，本發明還涉及該疫苗的制備方法。

背景技術

根據本項目委托廣東省科技情報研究所查新檢索國外文獻、專利結果：未見有草魚病疫苗或有關魚蝦爛鰓、敗血、赤皮等病疫苗的研發應用報導。國內從70年代開始，珠江水產研究所首先利用病魚肝、胰、腎等組織制備組織疫苗，免疫草魚能有效預防草魚出血、爛鰓、赤皮、腸炎等病發生，但是該法存在一定缺點：1、必須取材于發病魚，原材料受限；2、質量不穩定。80年代后在全國范圍開始草魚出血病滅活疫苗、活疫苗研發，并獲得成功。四川大學、廣東省藥物研究所與廣東省水產養技術推廣總站、武漢市水產科學研究所、湖南草魚免疫技術協作組等單位研發過草魚細菌性爛鰓病、赤皮病、腸炎病疫苗；并投入過中試，試用后養殖成活率提高至70％以上。但是，涉及本項：草魚細菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯滅活疫苗的研究與應用未見報導。

發明內容

為了解決草魚細菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯滅活疫苗純正抗原培育，“三病”抗原及佐劑的合理配制；克服全菌滅活疫苗免疫力低的不足。本發明提供一種草魚細菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯滅活疫苗，包括抗原和佐劑，其特征在于所述抗原為如下抗原組合物：柱狀屈橈桿菌培養物、嗜水氣單胞菌培養物、螢光極毛桿菌培養物，所述佐劑為MONTANIDE?ISA?763AVG和白油，其中柱狀屈橈桿菌培養物20～30億CFU/ml，30～39％，嗜水氣單胞菌培養物80億CFU/ml，8％，螢光極毛桿菌培養物80億CFU/ml，10％，佐劑MONTANIDE?ISA?763AVG?14％和白油10％。

本發明還提供該種草魚細菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯滅活疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括：

(1)柱狀屈橈桿菌培養物的制備

a菌種復蘇、復壯：將凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養基培養；

b種子鑒定及擴大培養：取培養菌種，劃線接種于胰蛋白胨瓊脂平板若干個，28℃培養48h，挑取至少5個假樹根狀菌落，接種于胰蛋白胨液體培養基，置28℃擴大培養成菌種；

c制苗菌液培養：將檢驗合格的菌種按胰蛋白胨培養基量2％接種到培養罐，以恒溫28℃、6M²/h的通氣量培養20～24h收獲20～30億CFU/ml培養物；

d純粹檢驗、活菌計數：在培養菌液中，取樣，分別接種適宜生長培養基斜面和硫乙醇酸鹽培養基小管各二支，每種培養基其中一支置37℃，另一支置25℃培養，觀察3～5天，菌種生長應純粹，采用10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度接種適宜生長瓊脂平板，每個稀釋度接種3個，每個接種0.2ml，使菌液均勻分布，晾干后翻轉平板，28℃培養48h；選擇菌落在40～200個之間計數，然后將平板平均數乘以稀釋倍數除以2，作為配苗參考；

e滅活：按細菌培養物體積比(V/V)加入終濃度為0.02％的硫柳汞溶液，30℃滅活2天。

f滅活檢驗：取經滅活的細菌培養物樣品，每個樣品1ml，接種于50ml胰蛋白胨培養基中，28℃，培養2天，再從培養物中取樣，接種胰蛋白胨培養基瓊脂斜面2支，每支接種0.2ml，28℃下培養3～5天，應無菌生長；

(2)嗜水氣單胞菌培養物的制備

A菌種復蘇、復壯：用少許蛋白胨培養基將凍干的嗜水氣單胞菌稀釋后，接種于蛋白胨培養基培養；

b種子鑒定及擴大培養：取復壯種子劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個，置28℃培養48h，挑取單個形成圓整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黃色，并有特殊氣味，不產色素的菌落至小5個，接種于蛋白胨培養基，28℃下擴大培養成菌種；

c制苗菌液培養：將檢驗合格的種子按培養基量2％接種量接種置種子罐，以恒溫28℃、40L/min的通氣量，攪拌培養20h，再接種置發酵罐，10M³/h通氣量，攪拌培養20h，收獲80億CFU/ml以上培養物；

d純粹檢驗、活菌計數：與“柱狀屈橈桿菌培養物純粹、活菌計數”方法相同；

e滅活：按嗜水氣單胞菌菌液體積比(V/V)加入終濃度為0.2％的甲醛溶液，37℃滅活2天。

f滅活檢驗：取經滅活的嗜水氣單胞菌菌液，每個樣品1ml，接種于50ml蛋白胨培養基中，28℃下培養3天，再從蛋白胨培養物中取樣，接種蛋白胨瓊脂斜面2支，每支接種0.2ml在28℃下培養3～5天，應無菌生長。

(3)螢光極毛桿菌培養物的制備