[發明專利]一種從肝素副產物純化硫酸乙酰肝素的方法

有效

• 申請號: 200910039359.9
• 申請日: 2009-05-11
• 公開（公告）號: CN101885787A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 李鋰;李坦
• 申請（專利權）人: 深圳市海普瑞藥業股份有限公司
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明涉及一種硫酸乙酰肝素的制備方法，尤其涉及一種從肝素副產物純化硫酸乙酰肝素的方法。

背景技術

硫酸乙酰肝素(heparan?sulfate，簡稱HS)，是一種天然的糖胺聚糖，由重復的二糖單位組成，其二糖為硫酸化的葡萄糖胺和己糖醛酸。廣泛分布于動物組織中，幾乎可以在所有細胞內合成。硫酸乙酰肝素與肝素的不同之處在于，其硫酸化程度要小一些，己糖醛酸中艾杜糖醛酸占的比例也小一些。

因為有報道HS具有抗腫瘤功能，HS的研究近年很受重視。但是硫酸乙酰肝素的獲得極為困難，試劑公司的HS價格極為昂貴，令許多研究者望而止步。國內很少有研究者進行HS的抗腫瘤試驗，多個研究小組關于微生物肝素酶III和動物類肝素酶的研究因缺乏HS作底物而難以進行。

生產肝素的過程產生的大量副產物中含有硫酸類肝素，本發明提供了一種新的工藝，從肝素副產物純化硫酸乙酰肝素，具有成本低廉、工藝簡單、容易放大為工業生產、獲得的硫酸乙酰肝素純度高等特點。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種從肝素副產物純化硫酸乙酰肝素的方法。

在生產肝素的過程中產生大量副產物，其中主要組成是硫酸皮膚素、肝素、硫酸乙酰肝素。本發明中建立了一種新的分離純化工藝，從肝素副產物純化硫酸乙酰肝素，本發明包括以下順序步驟：

(1)將肝素副產物溶解為2-10％的溶液，向其中加入醋酸鉀至10-80％濃度，攪拌溶解，以醋酸調節pH至5-7，在2-8℃沉淀1-7天。離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。

(2)向經過步驟(1)純化的硫酸多糖溶液中加入0.5-1.6倍體積的斑氏試劑和0.05-0.2倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10-60分鐘，離心分離清液和沉淀。

(3)向步驟(2)得到的沉淀中加入0.5-1.6倍體積的斑氏試劑，充分攪拌使溶解，然后加入0.05-0.2倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10-60分鐘，離心去沉淀。

(4)將步驟(2)和(3)得到的清液合并，用純化水稀釋，上一根陰離子交換性質的層析柱，以0.1-0.6M氯化鈉溶液洗去銅離子。然后以0-2.5M氯化鈉溶液線形濃度梯度洗脫，收集硫酸化糖胺聚糖濃度峰的幾管，旋轉蒸發濃縮后以乙醇沉淀，得到高純度的硫酸乙酰肝素。

步驟(1)所述的肝素副產物溶液濃度優選為5％-9％，進一步優選為8％，所述沉淀條件優選為3-6℃沉淀2-4天，進一步優選為4℃沉淀3天；步驟(2)、(3)所述的沉淀條件選選為0.6-1.2倍體積的斑氏試劑和0.08-0.15倍體積的飽和氫氧化鈉，進一步優選為0.8倍體積的斑氏試劑和0.1倍體積的飽和氫氧化鈉；步驟(4)所述陰離子交換性質的層析柱優選為Q-Sepharose?FF、DEAE-Sepharose?FF；步驟(4)所述從層析柱洗去銅離子的氯化鈉溶液濃度優選為0.2-0.4M，進一步優選為0.3M。

本發明所述制備方法，具有成本低廉、工藝簡單、容易放大為工業生產、獲得的硫酸乙酰肝素純度高、產品收率高等特點。用本發明所制得的硫酸類肝素用瓊脂糖電泳檢測未發現其它硫酸花氨基多糖條帶。

具體實施方式

下面結合實例對本發明所述內容作進一步闡述。

實施例一

將肝素副產物溶解為2％的溶液，向其中加入醋酸鉀至10％濃度，攪拌溶解，以醋酸調節pH至5，在2℃沉淀1天。離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。

向前述硫酸多糖溶液中加入0.5倍體積斑氏試劑和0.05倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入0.5倍體積的斑氏試劑，充分攪拌使溶解，然后加入0.05倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10分鐘，離心去沉淀。

將前兩步得到的清液合并，用2000ml純化水稀釋，上一根上Q-SepharoseFF柱，以0.1M氯化鈉洗滌300ml，以0-2.5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集含有硫酸乙酰肝素的管，合并溶液，65℃真空旋轉蒸發濃縮5倍，過濾，向濾液中加1/4體積水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀，烘干。所得沉淀經過HPLC測定純度為93.2％。

實施例二

將肝素副產物溶解為10％的溶液，向其中加入醋酸鉀至80％濃度，攪拌溶解，以醋酸調節pH至7，在2℃沉淀7天。離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。