[發明專利]畢赤酵母工程菌株的構建方法和右旋糖酐酶的制備工藝

無效

• 申請號: 200910039057.1
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101638666A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 梁達奉;曾練強;郭亭;盧英華;蟻細苗;李雨虹;陳龍軍;張遠平;黃玉南;鐘映萍;敬科舉
• 申請（專利權）人: 廣州甘蔗糖業研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/46;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司
• 代理人: 唐 弟

技術領域

本發明涉及基因工程領域和蛋白質的分泌表達領域，特別是分泌表達右旋糖酐酶的畢赤酵母工程菌株的構建，以及右旋糖酐酶的制備工藝。

背景技術

在制糖工業中，由于受甘蔗品種、天氣、土壤以及糖廠生產環境的影響，物料中都含有不同量的葡聚糖，造成直接的糖分損失高達1.0％左右；葡聚糖的存在使制糖工藝過程困難增加，主要體現在虛假旋光度的存在、糖液粘度增加、過濾困難、結晶不正常、能耗增加、品質降低等，因此而造成的糖分損失更是直接糖分損失的3-5倍，即傳統制糖過程中因葡聚糖原因造成糖分損失4％左右。因此，如何減少葡聚糖以及控制其負面影響是我國糖業界一個迫切需要解決的問題。

我國90％以上的制糖企業采用亞硫酸法制糖工藝，此工藝為了消除葡聚糖等大分子物質的影響，采用的清凈工藝通常加入石灰、二氧化硫、聚丙烯酰胺(絮凝劑)、表面活性劑，殺菌劑和脫色劑等數種物質當作提純劑除去葡聚糖、淀粉等，但其清凈效率不高、造成環境污染，清凈前后的純度差、并增加了外源的非糖物質，造成產出的白糖中葡聚糖的含量較高，這也就決定了后工序不可能結晶出高品質糖；直接影響其作為食品原料的加工性狀，如造成飲料渾濁、影響巧克力等糖果的成形和包裝等。隨著人們對食糖及添加食糖的食品質量的要求越來越高，葡聚糖的負面影響顯得越來越嚴重。因此，改進現有清凈工藝，提高清凈工藝的效率、減少葡聚糖造成的損失及其負面影響是我國制糖行業升級的關鍵技術瓶頸之一。

右旋糖酐酶是一種具有催化葡聚糖降解的活性蛋白質，可以在較溫和的條件下，除去葡聚糖，將其轉化成小分子的單糖或寡糖，降低粘度、加快沉降過濾速度、減少蒸煮時間、降低蒸汽消耗、提高糖的品質等，增加蔗糖的回收率。右旋糖酐酶在制糖中的作用效果非常顯著，據制糖專家James報道，在制糖過程中加入右旋糖酐酶后，糖分回收提高3-5％，糖的質量也明顯提高。右旋糖酐酶的應用能夠顯著的提升制糖產業的品質和競爭力。酶法清凈工藝對于提高效率、降低能耗和減少排污有顯著效果，是典型的綠色化學處理工藝。高效右旋糖酐酶及復合酶制劑的開發成功，能夠實現節能降耗、提升品質、提升競爭力，可有效消除葡聚糖在制糖行業的負面影響，無疑對制糖行業清潔生產、技術進步及促進產業發展具有顯著的積極意義。

目前右旋糖酐酶主要是從薄青霉(Penicillium?lilacinum)和細麗毛殼屬(Chaetomiumsp.)等菌株培養得到，亦有利用上述來源的基因進行工程菌構建的報道，但制備的右旋糖酐酶不能很好地適應制糖過程中的溫度和pH，且制備成本高，因此尚未有大量應用于制糖工業中的右旋糖酐酶的報道。

發明內容

本發明的目的是：

(1)提出能分泌表達畢赤酵母工程菌株的構建方法；

(2)提出利用畢赤酵母工程菌株制備右旋糖酐酶的工藝，其具有培養基碳源普通廉價，工藝條件簡單，制造成本低等優點。

本發明的技術方案如下：

一種畢赤酵母工程菌株的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

(1).設計寡核苷酸引物(Primer1：GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2：ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG)，引物中分別引入限制性內切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因組DNA為模板；克隆得到右旋糖酐酶基因，并進行測序鑒定。

(2).利用分泌表達載體pPIC9K，將EcoRI和NotI雙酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位點(EcoRI和NotI)，并通過連接、轉化、酶切等分子生物學技術操作，構建出整合分泌型表達載體(pPIC9K-139)。

(3).用限制性內切酶Bgl?II，對重組表達載體(pPIC9K-139)線性化，電擊轉化畢赤酵母GS115，借助α-facor分泌信號肽，實現右旋糖酐酶的高效分泌表達，在含有G418的YEPD平板上進行篩選，測定右旋糖酐酶酶活，得到重組畢赤酵母工程菌株(GS115-139)，該畢赤酵母工程菌株(GS115-139)的右旋糖酐酶可為多拷貝。

一種利用上述畢赤酵母工程菌株(GS115-139)制備右旋糖酐酶的工藝，其特征包括如下工序：

(1)培養基配方：基礎培養基由10×Basal?salt+250×PTM1+5％(w/v)葡萄糖+0.02％泡敵組成；

(2)接種：將畢赤酵母工程菌株(GS115-139)接種到上述培養基中培養；