[發明專利]畢赤酵母工程菌株的構建方法和右旋糖酐酶的制備工藝

無效

• 申請號: 200910039057.1
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101638666A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 梁達奉;曾練強;郭亭;盧英華;蟻細苗;李雨虹;陳龍軍;張遠平;黃玉南;鐘映萍;敬科舉
• 申請（專利權）人: 廣州甘蔗糖業研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/46;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司
• 代理人: 唐 弟

1.一種畢赤酵母工程菌株的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)設計寡核酐酸引物Primer1：GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2：ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG，引物中分別引入限制性內切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因組DNA為模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；

(2)利用分泌表達載體pPIC9K，將雙酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位點(EcoRI和NotI)，并通過連接、轉化、酶切等分子生物學技術操作，構建出整合分泌型表達載體(pPIC9K-139)；

(3)用限制性內切酶Bgl?II，對重組表達載體(pPIC9K-139)線性化，電擊轉化畢赤酵母GS115，采用α-factor，實現右旋糖酐酶的分泌表達，在含有G418的YEPD平板上進行篩選，得到重組畢赤酵母工程菌株(GS115-139)。

2.根據權利要求1所述的畢赤酵母工程菌株的構建方法，其特征在于：所述的畢赤酵母工程菌株(GS115-139)的右旋糖酐酶基因為多拷貝。

3.一種制備右旋糖酐酶的工藝，其特征包括如下工序為：

(1)培養基配方：基礎培養基由10×Basal?salt+250×PTM1+5％(w/v)葡萄糖+0.02％泡敵組成；

(2)接種：將如權利要求1或2所述的畢赤酵母工程菌株(GS115-139)接種到上述培養基中培養，培養條件為：溫度25～35℃，PH5.0～7.0，溶氧量大于20％；

(3)誘導產右旋糖酐酶：接種培養24-48小時后，流加甲醇，甲醇濃度在0～1％范圍；

(4)分離提純右旋糖酐酶：采用離心、過濾的方法分離細胞，然后選擇適當超濾膜截流、濃縮發酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶。