[發明專利]酸性蛋白酶

有效

• 申請號: 200910037474.2
• 申請日: 2009-03-02
• 公開（公告）號: CN101492664A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 羅曉春;潘進權;王菊芳;謝明權;王小寧
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12R1/785
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及一種酸性蛋白酶，特別涉及一種水解效率高的酸性蛋白酶。

背景技術

大豆中含有40％的蛋白質，它可以提供動物所需要的8種必需氨基酸、多 種維生素和礦物質。大豆蛋白資源十分豐富，原料成本低廉，具有乳化性、起 泡性等功能特性。但同時，大豆蛋白含有一些引起過敏反應的抗原物質——致 敏因子，大豆蛋白引起過敏反應的主要抗原成分為大豆球蛋白和β-伴大豆球 蛋白。解決的主要方法就是將其酶解，大豆蛋白經水解后其酶解物比氨基酸和 蛋白質更易于消化吸收，還能改變其溶解性、降低粘度。

水解大豆蛋白的方法有3種，酸法、堿法和酶法。酸堿法是用酸、堿等化 學試劑在一定溫度下促使蛋白質分子的肽鏈斷裂形成小分子物質。但由于堿法 水解使氨基酸大多消旋，無生物利用價值，因此不宜采用；而酸法多采用鹽酸、 硫酸等強酸在高溫下反應，反應強烈，設備腐蝕嚴重，水解徹底，多生成氨基 酸混合物，同時在高溫下色氨酸完全被破壞，目前漸被淘汰。酶法水解大豆蛋 白的研究，最初是始于利用酶部分降解蛋白質，增加其分子內或分子間交聯或 連接特殊功能基團，改變蛋白質的功能性質，以獲得良好加工特性的研究。到 了80年代，隨著酶制劑工業和食品工業的迅猛發展，人們逐漸發現，利用酶 法改性，不僅反應條件溫和，安全可靠，產品色淺，而且水解產物在營養、風 味、工藝等方面均優于酸、堿水解法，因而人們的注意力集中在蛋白水解產物 多肽上。酶法選擇性較強，但水解率偏低。

因此，需要發明一種新的酸性蛋白酶以解決上述問題。

發明內容

本發明的主要目的之一在于基于現有技術的不足而提供一種水解率高的 酸性蛋白酶。

本發明提供一種酸性蛋白酶，能在酸性條件下水解蛋白質，其特征在于， 所述酸性蛋白酶具有以下物理化學特性：

a)所述的酸性蛋白酶通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的估測分子量為 33kDa；

b)所述的酸性蛋白酶的N端序列為GTGTVPVTDV；

c)所述的酸性蛋白酶最適作用溫度為50℃；所述的酸性蛋白酶在溫度低于 45℃時有很好的熱穩定性；

d)所述的酸性蛋白酶最適作用pH為pH5.5，在pH4.0～7.0能保持很好的穩定 性；

e)胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin?A)對所述的酸性蛋白酶有非常顯著的抑制作用， 所述的酸性蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族；

f)所述的酸性蛋白酶在胰島素B鏈上擁有強弱不等的12個酶切位點；

g)所述的酸性蛋白酶由雅致放射毛霉AS3.2778分離提純得到。

毛霉是我國傳統豆類發酵食品的主要生產菌種之一，有著悠久的應用歷 史。由于長期受到環境條件(高蛋白培養基)的馴化，毛霉具有分泌多種胞外 蛋白酶的能力；而且，其胞外蛋白酶系對大豆蛋白有相對較強的適應性，顯示 出很強的水解能力；其水解大豆蛋白得到的產物主要以小肽為主，有很高的水 解度，且不會產生苦味。本發明的酸性蛋白酶(命名為Pa2)能夠解決大豆蛋 白水解中的主要技術難題，水解效率高，水解產物沒有強烈的苦味。

作為本發明的優選實施方式，所述的酸性蛋白酶對三種底物的水解活性為 酪蛋白(Casein)＞大豆分離蛋白(soy?protein?isolated，SPI)＞牛血清白蛋白 (BSA)。

作為本發明的優選實施方式，所述的酸性蛋白酶米氏常數Km為2.126g/L， 活化能Ea為42.31kJ。

本發明以雅致放射毛霉AS3.2778為對象，采用了多種層析操作相結合的 方法，包括離子交換、疏水層析等，從蛋白質性質的不同角度對毛霉酸性蛋白 酶組分進行純化，通過這些手段得到電泳純的酸性蛋白酶Pa2，然后檢測該酶 的酶學參數、水解蛋白的酶切位點、N端序列鑒定，及其對大豆蛋白的水解效 率等，為其蛋白水解的應用提供具體參數。

附圖說明

圖1為鹽析沉淀的電泳分析圖，泳道1為蛋白質marker，泳道2為80S蛋 白沉淀，泳道3為75S蛋白沉淀，泳道4為70S蛋白沉淀，泳道5為65S蛋白 沉淀，泳道6為60S蛋白沉淀，泳道7為50S蛋白沉淀，泳道8為45S蛋白沉 淀，泳道9為40S蛋白沉淀，泳道10為35S蛋白沉淀；

圖2為酸性組分Pa2?CM-Sepharose離子交換洗脫曲線圖，左起第三個峰 為Pa2活性峰；