[發明專利]菊花滑刃線蟲的檢測方法及診斷試劑盒

無效

• 申請號: 200910037299.7
• 申請日: 2009-02-20
• 公開（公告）號: CN101812502A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 崔汝強;劉中勇;胡學難;鐘國強;趙立榮;馮黎霞;孫曉棠;吳海榮;胡佳
• 申請（專利權）人: 崔汝強
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 戴建波

技術領域

本發明涉及一種檢測或鑒別菊花滑刃線蟲的方法以及一種可檢測 菊花滑刃線蟲的診斷試劑盒。

背景技術

菊花滑刃線蟲(Aphelenchoides?ritzemabosi)是花卉重要的植 物寄生線蟲病害之一，其寄主廣泛，能在觀賞植物、蔬菜類、小果類和 雜草等200多種植物上寄生。該線蟲主要危害葉片，同時也能侵染花芽 和花。該線蟲除危害菊花外，還危害翠菊、金光菊、大麗菊、百日草等 多種菊科植物，以及茄科植物或罌粟科植物，或煙草、草莓、珠蘭、百 合、蒲包花、飛燕草、夾竹桃等作物或花卉。被害株葉片枯死，開花不 好或不能開花，重則整株變黑，最終導致植株枯死。菊花滑刃線蟲分布 廣泛，在日本、美國菊花葉線蟲病被認為是菊花的災難性病害。全世界 有75個國家在菊花上發現這種病害，損失率達12.3％，因而被我國列 為對內對外重要的檢疫線蟲。

菊花滑刃線蟲主要是種苗帶病傳播，一旦侵入植株就難以用藥劑防 治，只能及時拔除，集中燒毀，因此防治的主要措施是通過檢疫進行隔 絕。然而，目前的檢測手段主要是用直接浸泡法或貝曼漏斗法分離線蟲， 然后鏡檢，根據菊花滑刃線蟲的形態特征進行判斷。這種方法存在一定 的弊端，主要表現在：一、菊花滑刃線蟲屬于滑刃線蟲屬，滑刃線蟲種 類繁多，通常鑒定的樣品中會有多種形態相似的線蟲，這就要求鑒定者 具有豐富的經驗；二、線蟲個體間存在差異，這需要有足夠的鑒定樣本； 三、形態學鑒定只適用于成蟲，而對于幼蟲不適用。因此，研究出對菊 花滑刃線蟲快速、準確的檢測方法實為必要。

發明內容

為克服上述缺陷，本發明的目的之一在于提供一種快速、準確地檢 測出菊花滑刃線蟲的方法。本發明的另一目的在于提供菊花滑刃線蟲診 斷用試劑盒。

為實現上述目的，本發明提供的菊花滑刃線蟲的檢測方法包括：

(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測線蟲，提取DNA；

(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID NO：2的引物，進行聚合酶鏈式反應，得到擴增產物；

(c)檢測步驟(b)中獲得的擴增產物，根據檢測結果判斷菊花滑 刃線蟲的存在。

優選地，步驟(c)中所述的檢測的方法為電泳檢測，更優選為瓊 脂糖凝膠電泳。通過瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測出擴增產物中 是否含有特異性擴增的片段，以及該片段的大小。

本發明的方法利用分子生物學原理，使用發明人設計的如序列表中 所列的一對特異性引物，來擴增菊花滑刃線蟲的基因組DNA。如果待檢 測的線蟲確為菊花滑刃線蟲，則通過聚合酶鏈式反應(PCR)后可獲得 擴增的特異性片段，當電泳檢測時，會顯示出特異性條帶；如果待檢測 的線蟲非菊花滑刃線蟲，則通過PCR后不能獲得擴增的特異性片段，當 電泳檢測時，就不會顯示出特異性條帶。因此，可通過電泳檢測結果中 是否出現特異性條帶來判斷出待檢測線蟲是否為菊花滑刃線蟲。

為更好地實現本發明，針對不同數量的線蟲，其DNA提取方法可分 為：

(1)當所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲時，采用Miniprep DNA提取法分離出DNA。

(2)當所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲時，步驟(a)中 所述的提取包括以下步驟：

(i)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中；

(ii)于-70℃放置30-60min；95℃放置15-20min；55-65℃放 置2min；

(3)再加入蛋白酶K，55-65℃處理30min-2h；95℃處理15-20min， 以獲得作為單條線蟲DNA模板的產物。

優選地，上述植物材料是菊科植物材料、茄科植物材料或罌粟科植 物材料。所述菊科植物選自翠菊、金光菊、大麗菊和百日草的種苗或植 株。

在另一實施方式中，所述植物材料是煙草、草莓、珠蘭、百合、蒲 包花、飛燕草或夾竹桃的種苗或植株。

另一方面，為了更方便地使用本發明的方法，本發明還提供一種用 于診斷菊花滑刃線蟲的試劑盒，其包含SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2的 引物對。

本發明的方法適用于土樣、種苗和植株樣品中菊花滑刃線蟲的快速 檢測和鑒定，與現有方法相比，本發明的優點表現在：