[發明專利]菊花滑刃線蟲的檢測方法及診斷試劑盒無效
| 申請號: | 200910037299.7 | 申請日: | 2009-02-20 |
| 公開(公告)號: | CN101812502A | 公開(公告)日: | 2010-08-25 |
| 發明(設計)人: | 崔汝強;劉中勇;胡學難;鐘國強;趙立榮;馮黎霞;孫曉棠;吳海榮;胡佳 | 申請(專利權)人: | 崔汝強 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68 |
| 代理公司: | 廣州三環專利代理有限公司 44202 | 代理人: | 戴建波 |
| 地址: | 510623 廣東省廣*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 菊花 線蟲 檢測 方法 診斷 試劑盒 | ||
技術領域
本發明涉及一種檢測或鑒別菊花滑刃線蟲的方法以及一種可檢測 菊花滑刃線蟲的診斷試劑盒。
背景技術
菊花滑刃線蟲(Aphelenchoides?ritzemabosi)是花卉重要的植 物寄生線蟲病害之一,其寄主廣泛,能在觀賞植物、蔬菜類、小果類和 雜草等200多種植物上寄生。該線蟲主要危害葉片,同時也能侵染花芽 和花。該線蟲除危害菊花外,還危害翠菊、金光菊、大麗菊、百日草等 多種菊科植物,以及茄科植物或罌粟科植物,或煙草、草莓、珠蘭、百 合、蒲包花、飛燕草、夾竹桃等作物或花卉。被害株葉片枯死,開花不 好或不能開花,重則整株變黑,最終導致植株枯死。菊花滑刃線蟲分布 廣泛,在日本、美國菊花葉線蟲病被認為是菊花的災難性病害。全世界 有75個國家在菊花上發現這種病害,損失率達12.3%,因而被我國列 為對內對外重要的檢疫線蟲。
菊花滑刃線蟲主要是種苗帶病傳播,一旦侵入植株就難以用藥劑防 治,只能及時拔除,集中燒毀,因此防治的主要措施是通過檢疫進行隔 絕。然而,目前的檢測手段主要是用直接浸泡法或貝曼漏斗法分離線蟲, 然后鏡檢,根據菊花滑刃線蟲的形態特征進行判斷。這種方法存在一定 的弊端,主要表現在:一、菊花滑刃線蟲屬于滑刃線蟲屬,滑刃線蟲種 類繁多,通常鑒定的樣品中會有多種形態相似的線蟲,這就要求鑒定者 具有豐富的經驗;二、線蟲個體間存在差異,這需要有足夠的鑒定樣本; 三、形態學鑒定只適用于成蟲,而對于幼蟲不適用。因此,研究出對菊 花滑刃線蟲快速、準確的檢測方法實為必要。
發明內容
為克服上述缺陷,本發明的目的之一在于提供一種快速、準確地檢 測出菊花滑刃線蟲的方法。本發明的另一目的在于提供菊花滑刃線蟲診 斷用試劑盒。
為實現上述目的,本發明提供的菊花滑刃線蟲的檢測方法包括:
(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測線蟲,提取DNA;
(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板,使用SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID NO:2的引物,進行聚合酶鏈式反應,得到擴增產物;
(c)檢測步驟(b)中獲得的擴增產物,根據檢測結果判斷菊花滑 刃線蟲的存在。
優選地,步驟(c)中所述的檢測的方法為電泳檢測,更優選為瓊 脂糖凝膠電泳。通過瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測出擴增產物中 是否含有特異性擴增的片段,以及該片段的大小。
本發明的方法利用分子生物學原理,使用發明人設計的如序列表中 所列的一對特異性引物,來擴增菊花滑刃線蟲的基因組DNA。如果待檢 測的線蟲確為菊花滑刃線蟲,則通過聚合酶鏈式反應(PCR)后可獲得 擴增的特異性片段,當電泳檢測時,會顯示出特異性條帶;如果待檢測 的線蟲非菊花滑刃線蟲,則通過PCR后不能獲得擴增的特異性片段,當 電泳檢測時,就不會顯示出特異性條帶。因此,可通過電泳檢測結果中 是否出現特異性條帶來判斷出待檢測線蟲是否為菊花滑刃線蟲。
為更好地實現本發明,針對不同數量的線蟲,其DNA提取方法可分 為:
(1)當所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲時,采用Miniprep DNA提取法分離出DNA。
(2)當所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲時,步驟(a)中 所述的提取包括以下步驟:
(i)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中;
(ii)于-70℃放置30-60min;95℃放置15-20min;55-65℃放 置2min;
(3)再加入蛋白酶K,55-65℃處理30min-2h;95℃處理15-20min, 以獲得作為單條線蟲DNA模板的產物。
優選地,上述植物材料是菊科植物材料、茄科植物材料或罌粟科植 物材料。所述菊科植物選自翠菊、金光菊、大麗菊和百日草的種苗或植 株。
在另一實施方式中,所述植物材料是煙草、草莓、珠蘭、百合、蒲 包花、飛燕草或夾竹桃的種苗或植株。
另一方面,為了更方便地使用本發明的方法,本發明還提供一種用 于診斷菊花滑刃線蟲的試劑盒,其包含SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的 引物對。
本發明的方法適用于土樣、種苗和植株樣品中菊花滑刃線蟲的快速 檢測和鑒定,與現有方法相比,本發明的優點表現在:
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