[發(fā)明專(zhuān)利]菊花滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)方法及診斷試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910037299.7
• 申請(qǐng)日: 2009-02-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101812502A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔汝強(qiáng);劉中勇;胡學(xué)難;鐘國(guó)強(qiáng);趙立榮;馮黎霞;孫曉棠;吳海榮;胡佳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 崔汝強(qiáng)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環(huán)專(zhuān)利代理有限公司 44202
• 代理人: 戴建波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)或鑒別菊花滑刃線蟲(chóng)的方法以及一種可檢測(cè) 菊花滑刃線蟲(chóng)的診斷試劑盒。

背景技術(shù)

菊花滑刃線蟲(chóng)(Aphelenchoides?ritzemabosi)是花卉重要的植 物寄生線蟲(chóng)病害之一，其寄主廣泛，能在觀賞植物、蔬菜類(lèi)、小果類(lèi)和 雜草等200多種植物上寄生。該線蟲(chóng)主要危害葉片，同時(shí)也能侵染花芽 和花。該線蟲(chóng)除危害菊花外，還危害翠菊、金光菊、大麗菊、百日草等 多種菊科植物，以及茄科植物或罌粟科植物，或煙草、草莓、珠蘭、百 合、蒲包花、飛燕草、夾竹桃等作物或花卉。被害株葉片枯死，開(kāi)花不 好或不能開(kāi)花，重則整株變黑，最終導(dǎo)致植株枯死。菊花滑刃線蟲(chóng)分布 廣泛，在日本、美國(guó)菊花葉線蟲(chóng)病被認(rèn)為是菊花的災(zāi)難性病害。全世界 有75個(gè)國(guó)家在菊花上發(fā)現(xiàn)這種病害，損失率達(dá)12.3％，因而被我國(guó)列 為對(duì)內(nèi)對(duì)外重要的檢疫線蟲(chóng)。

菊花滑刃線蟲(chóng)主要是種苗帶病傳播，一旦侵入植株就難以用藥劑防 治，只能及時(shí)拔除，集中燒毀，因此防治的主要措施是通過(guò)檢疫進(jìn)行隔 絕。然而，目前的檢測(cè)手段主要是用直接浸泡法或貝曼漏斗法分離線蟲(chóng)， 然后鏡檢，根據(jù)菊花滑刃線蟲(chóng)的形態(tài)特征進(jìn)行判斷。這種方法存在一定 的弊端，主要表現(xiàn)在：一、菊花滑刃線蟲(chóng)屬于滑刃線蟲(chóng)屬，滑刃線蟲(chóng)種 類(lèi)繁多，通常鑒定的樣品中會(huì)有多種形態(tài)相似的線蟲(chóng)，這就要求鑒定者 具有豐富的經(jīng)驗(yàn)；二、線蟲(chóng)個(gè)體間存在差異，這需要有足夠的鑒定樣本； 三、形態(tài)學(xué)鑒定只適用于成蟲(chóng)，而對(duì)于幼蟲(chóng)不適用。因此，研究出對(duì)菊 花滑刃線蟲(chóng)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法實(shí)為必要。

發(fā)明內(nèi)容

為克服上述缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確地檢 測(cè)出菊花滑刃線蟲(chóng)的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供菊花滑刃線蟲(chóng)診 斷用試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的菊花滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)方法包括：

(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測(cè)線蟲(chóng)，提取DNA；

(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID NO：2的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

(c)檢測(cè)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷菊花滑 刃線蟲(chóng)的存在。

優(yōu)選地，步驟(c)中所述的檢測(cè)的方法為電泳檢測(cè)，更優(yōu)選為瓊 脂糖凝膠電泳。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物中 是否含有特異性擴(kuò)增的片段，以及該片段的大小。

本發(fā)明的方法利用分子生物學(xué)原理，使用發(fā)明人設(shè)計(jì)的如序列表中 所列的一對(duì)特異性引物，來(lái)擴(kuò)增菊花滑刃線蟲(chóng)的基因組DNA。如果待檢 測(cè)的線蟲(chóng)確為菊花滑刃線蟲(chóng)，則通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后可獲得 擴(kuò)增的特異性片段，當(dāng)電泳檢測(cè)時(shí)，會(huì)顯示出特異性條帶；如果待檢測(cè) 的線蟲(chóng)非菊花滑刃線蟲(chóng)，則通過(guò)PCR后不能獲得擴(kuò)增的特異性片段，當(dāng) 電泳檢測(cè)時(shí)，就不會(huì)顯示出特異性條帶。因此，可通過(guò)電泳檢測(cè)結(jié)果中 是否出現(xiàn)特異性條帶來(lái)判斷出待檢測(cè)線蟲(chóng)是否為菊花滑刃線蟲(chóng)。

為更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，針對(duì)不同數(shù)量的線蟲(chóng)，其DNA提取方法可分 為：

(1)當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲(chóng)時(shí)，采用Miniprep DNA提取法分離出DNA。

(2)當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲(chóng)時(shí)，步驟(a)中 所述的提取包括以下步驟：

(i)將單條線蟲(chóng)加入含有WLB溶液的管中；

(ii)于-70℃放置30-60min；95℃放置15-20min；55-65℃放 置2min；

(3)再加入蛋白酶K，55-65℃處理30min-2h；95℃處理15-20min， 以獲得作為單條線蟲(chóng)DNA模板的產(chǎn)物。

優(yōu)選地，上述植物材料是菊科植物材料、茄科植物材料或罌粟科植 物材料。所述菊科植物選自翠菊、金光菊、大麗菊和百日草的種苗或植 株。

在另一實(shí)施方式中，所述植物材料是煙草、草莓、珠蘭、百合、蒲 包花、飛燕草或夾竹桃的種苗或植株。

另一方面，為了更方便地使用本發(fā)明的方法，本發(fā)明還提供一種用 于診斷菊花滑刃線蟲(chóng)的試劑盒，其包含SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2的 引物對(duì)。

本發(fā)明的方法適用于土樣、種苗和植株樣品中菊花滑刃線蟲(chóng)的快速 檢測(cè)和鑒定，與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：