[發明專利]水稻干尖線蟲的檢測方法及診斷試劑盒

無效

• 申請號: 200910037297.8
• 申請日: 2009-02-20
• 公開（公告）號: CN101812501A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 崔汝強;卓侃;胡學難;孫曉棠;廖金鈴;鐘國強;郭權;王衛芳
• 申請（專利權）人: 崔汝強
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 戴建波

技術領域

本發明涉及一種檢測或鑒定水稻干尖線蟲的方法以及一種檢測或 鑒定水稻干尖線蟲的試劑盒。

背景技術

水稻干尖線蟲(Aphelenchoides?besseyi?Christie)，又稱貝西 滑刃線蟲，寄主最主要是水稻，可引起水稻干尖或白尖病，全國各水稻 產區都有發生，一般可造成減產10％-20％，嚴重者可達30％以上。其還 會引起草莓的夏矮病，受害草莓葉片皺縮畸形、植株矮化、開花減少， 產量大大降低。同時，該線蟲也是玉米、甘薯、大豆、蔬菜、蘭花、菊 花、大麗花等作物或花卉的重要病害，導致經濟價值降低。

水稻干尖線蟲主要是種子帶病傳播，一旦侵入植株就難以用藥劑防 治，只能及時拔除，集中燒毀，因此防治的主要措施是通過檢疫進行隔 絕。

中國專利申請98111429.6公開了一種采用二硫氰基甲烷或其鹽類 化合物，通過浸種、拌種或種子包衣技術來防治水稻干尖線蟲病、惡苗 病、胡麻斑病、苗稻瘟病、大、小麥、青稞和玉米等作物條紋病、堅黑 穗病、腥黑穗病、網斑病、紋枯病的方法。

中國專利申請200710158025.4公開了具毒殺植物寄生線蟲作用的 真菌的培養方法及其代謝物制備方法和應用，該申請所公開的木霉菌菌 株Snef85為哈茨木霉Trichoderma?harzianum，其代謝產物對植物寄生 線蟲，特別是對南方根結線蟲、水稻干尖線蟲和大豆胞囊線蟲具有毒力 高，殺線蟲效果明顯的突出特點。

中國專利申請200810010465.X則公開了具毒殺植物線蟲作用的鏈 霉菌的培養方法及其代謝物制備方法和應用，該申請所公開的鏈霉菌菌 株Snea253為委內瑞拉鏈霉菌Streptomyces?venezuelae，其代謝產物 對植物寄生線蟲，特別是對大豆胞囊線蟲、根結線蟲和水稻干尖線蟲具 有很高毒力。

防治水稻干尖線蟲的基礎是首先對水稻干尖線蟲進行檢測。然而， 到目前為止，針對水稻干尖線蟲的檢測方法仍是傳統的方法，其檢測手 段主要是用直接浸泡法或貝曼漏斗法分離線蟲，然后鏡檢，根據水稻干 尖線蟲的形態特征進行判斷。這種方法存在一定的弊端，主要表現在： 一、水稻干尖線蟲屬于滑刃線蟲屬，滑刃線蟲種類繁多，通常鑒定的樣 品中會有多種形態相似的線蟲，這就要求鑒定者具有豐富的經驗；二、 線蟲個體間存在差異，這需要有足夠的鑒定樣本；三、形態學鑒定只適 用于成蟲，而對于幼蟲不適用。

因此，研究出對水稻干尖線蟲快速、準確的檢測方法實為必要。

發明內容

為克服上述缺陷，本發明的目的之一在于提供一種快速、準確地檢 測出水稻干尖線蟲的方法。本發明的另一目的在于提供水稻干尖線蟲病 診斷用試劑盒。

為實現上述目的，本發明提供的水稻干尖線蟲的檢測方法包括：

(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測線蟲，提取DNA；

(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID NO：2的引物，進行聚合酶鏈式反應，得到擴增產物；

(c)檢測步驟(b)中獲得的擴增產物，根據檢測結果判斷水稻干 尖線蟲的存在。

優選地，步驟(c)中所述的檢測的方法為電泳檢測，更優選為瓊 脂糖凝膠電泳。通過瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測出擴增產物中 是否含有特異性擴增的片段，以及該片段的大小。

本發明的方法利用分子生物學原理，使用發明人設計的如序列表中 所列的一對特異性引物，來擴增水稻干尖線蟲的基因組DNA。如果待檢 測的線蟲確為水稻干尖線蟲，則通過聚合酶鏈式反應(PCR)后可獲得 擴增的特異性片段，當電泳檢測時，會顯示出特異性條帶；如果待檢測 的線蟲非水稻干尖線蟲，則通過PCR后不能獲得擴增的特異性片段，當 電泳檢測時，就不會顯示出特異性條帶。因此，可通過電泳檢測結果中 是否出現特異性條帶來判斷出待檢測線蟲是否為水稻干尖線蟲。

為更好地實現本發明，針對不同數量的線蟲，其DNA提取方法可分 為：

(1)當所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲時，采用酚氯仿 提取法(也稱作“Miniprep法”)分離出DNA。

(2)當所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲時，步驟(a)中 所述的提取包括以下步驟：

(i)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中；