[發明專利]一種雜合抗菌肽CA-MA及其重組表達方法

無效

• 申請號: 200910036902.X
• 申請日: 2009-01-22
• 公開（公告）號: CN101481420A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 張文慶;金豐良;許小霞;汪延生;陳宏鑫;王娟
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N15/74;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘 暉

技術領域

本發明涉及一種雜合抗菌肽CA-MA及其重組表達方法，屬于生物技 術領域。

背景技術

抗菌肽(antibacterial?peptides)是宿主產生的一類抵抗外界病原 體感染的小分子陽離子肽(Milner?et?al.，1996；Bals?et?al.，1999)， 廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內，除有非特異性抗細菌、真菌、 病毒等病原體作用外(Bellm?et?al.，2000；Hancock?et?al.，2000)，還 有抗腫瘤細胞作用，因此又稱為肽抗生素(peptide?antibiotics)。抗 菌肽抗菌譜廣，對多重耐藥菌、腫瘤細胞、艾滋病毒有殺傷作用，甚至 還可能有抗重癥急性呼吸綜合征(severe?acute?kespiratory?syndrome， SARS)病毒的作用，抗菌肽獨特的殺菌機制，使其成為一類具有巨大發 展潛力的新型抗菌藥物。但天然抗菌肽在昆蟲組織中的含量很少，直接 從昆蟲血淋巴中純化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁瑣，并且在應用 中表現出單一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌譜窄等缺陷。這些都不利于 抗菌肽的廣泛應用。目前國內外學者都借助于基因工程的手段，根據抗 菌肽構效和功能的關系，將已知的抗菌肽結構進行改造(Andreu?et al，1985；Fink?et?al，1989)或將已知功能的抗菌肽活性部位雜合(Song， 2000)，在體外進行高效表達，希望獲得抗菌活力更強，抗菌譜更廣的 抗菌肽(黃音等，2001；周霞等，2003；黃亞東等，2003a，b)。然后 對獲得的抗菌肽在體外進行高效表達，以期達到應用的目的(邱定紅等， 2002；朱嘉明等，2002；陳海旭等，2001；葉玉坤等，1994；韓萬江等， 1998；陳海旭等，2002)。

但抗菌肽的應用，需要大量的、高活性的抗菌肽做基礎，而抗菌肽 在天然組織中含量少，直接從天然組織中分離純化抗菌肽成本太高，得 率低，工序繁瑣，這些都不利于抗菌肽的廣泛應用。基因工程生產抗菌 肽是一個較為理想的選擇，但是由于抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解， 同時由于其表達產物對宿主菌有害，因此不能在原核系統中直接表達， 一般采用真核表達或融合表達的形式(Bryksa?et?al.，2005)。至今， 抗菌肽已在原核表達系統(Skosyrev?et?al.，2003)、昆蟲細胞表達系 統(Yamada?et?al.，1990)、酵母表達系統得到表達(Aly?et?al.，1999； Li?et?al.，2005；Almeida?et?al.，2001；Cabral?et?al.，2003；金 豐良等，2005；Jin?et?al.，2006)。但是在表達過程中發現，表達的 抗菌肽對宿主細胞有毒性，而且對宿主本身的蛋白酶非常敏感導致降 解，這些都降低了抗菌肽的表達量。近幾年來，在原核細胞中采用融合 的形式表達抗菌肽已經成為研究者的熱點(Smith?et?al.，1988；Pryor et?al.，1997；Guan?et?al.，1988；LaVallie?et?al.，1993，1995； Tenno?et?al.，2004)。大腸桿菌的遺傳背景清楚，體外操作容易，可 大規模、高密度發酵且培養基成分要求簡單，一直是基因工程多肽類藥 物生產研究中的首選表達宿主細胞(Harris?et?al.，1983)。將抗菌肽 和分子伴侶在細菌中融合表達，分子伴侶不僅降低了抗菌肽對宿主菌的 毒性，而且保護了抗菌肽不被蛋白酶所降解。抗菌肽已經和麥芽糖結合 蛋白(maltose-binding?protein，MBP)(陳海旭等，2001；Hara?et al.，1996)、谷胱胺肽S轉移酶(glutathione?S-transferase，GST) (Skosyrev?et?al.，2003；王來城等，2005；Feng?et?al.，2006)、綠 色熒光蛋白(Green-fluorescent?protein，GFP)(盧強等，2002)在大 腸桿菌中成功實現了融合表達。研究中發現，大部分的融合蛋白多呈包 涵體的形式存在，增加了抗菌肽的純化難度(盧強等，2002；王來城等， 2005；Li?et?al.，2006)，而且融合蛋白在外源蛋白酶切割時，往往出 現切割不完全或增加了抗菌肽N端多余的氨基酸(Wu?et?al.，1999； Liang?et?al.，2006)，這些都降低了抗菌肽的產量和活性。而且外源 蛋白酶的使用，使抗菌肽的純化變得不經濟。