[發明專利]一種雜合抗菌肽CA-MA及其重組表達方法

無效

• 申請號: 200910036902.X
• 申請日: 2009-01-22
• 公開（公告）號: CN101481420A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 張文慶;金豐良;許小霞;汪延生;陳宏鑫;王娟
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N15/74;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘 暉

1.一種雜合抗菌肽，其特征在于：它為以下氨基酸序列：KKIGKKIE?GIGKFLHSAKKF。

2.根據權利要求1所述雜合抗菌肽的重組表達方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）選擇家蠅cecropinA前8個氨基酸序列和非洲爪蟾magainin2的前12個氨基酸序列設計雜合抗菌肽的cDNA；

（2）根據細菌偏愛的密碼子，設計引物P1和P2，

P1:5'-AGCCCGCGGTGGCATGAAATGGAAGATTGGTAAGAAAATCGGCATTGGTAAGTTCTTA-3'，CCGCGG表示引入的酶切位點為Sac?II，

P2:5'-GGCAAGCTTTTAGTTGAATTTCTTAGCAGAATGTAAGAACTTACCAATGCCGA-3'，AAGCTT表示引入的酶切位點為HindⅢ；

（3）進行常規鏈式聚合酶反應擴增雜合抗菌肽的cDNA；

（4）構建雜合抗菌肽表達質粒pQEUBICAMA；

（5）表達質粒pQEUBICAMA在原核細胞中進行高效融合表達，得到融合蛋白UBICAMA；

（6）融合蛋白UBICAMA的純化：將步驟（5）所得的融合蛋白UBICAMA經鎳螯和層析進行融合蛋白的純化；

（7）雜合抗菌肽的獲得：用家蠅泛素C-末端水解酶對步驟（6）所得融合蛋白UBICAMA進行酶切，然后依次經鎳螯和層析和超濾法進行雜合抗菌肽的純化；

步驟（4）所述重組表達質粒pQEUBICAMA的構建包括以下步驟：

（a）原核表達質粒pQEUBI的構建：設計一對特定引物PUF和PUR，以原核表達載體pQE30為模板，利用常規鏈式聚合酶反應將家蠅泛素的C末端堿基T²²¹突變C，使其含有BamHⅠ、Sac?II和HindⅢ酶切位點以及家蠅泛素C-末端水解酶的識別序列；然后經過質量分數為0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收，再經BamHⅠ和HindⅢ酶切雙切后插入到載體pQE30的BamHⅠ和HindⅢ酶切窗口，構建成原核表達質粒pQEUBI；

（b）將雜合抗菌肽的cDNA進行SacⅡ和HindⅢ雙酶切，膠純化回收后，與經同樣酶切回收的質粒pQEUBI體外連接，構建重組表達質粒pQEUBICAMA；

所述的特定引物PUF和PUR是：

PUF：5'–GCGGGATCC?ATGCAGATTTTC?GTGAAAACC-3'，

PUR：5'–GAAGCTTTTAGCCACCGCGGAGGCGAAGGACC-3'。

3.根據權利要求2所述雜合抗菌肽的重組表達方法，其特征在于：步驟（3）所述常規鏈式聚合酶反應的具體步驟如下：將混合液在94℃預變性5min，然后進入下列循環：94℃、40秒，55℃、40秒，72℃、50秒，共進行35個循環，最后72℃延伸7分鐘，擴增完畢后置4℃終止反應；

所述混合液組成如下：

含20?mM?Mg²⁺的10×PCR?緩沖液????????????????????????5?μl

濃度為2.5?mM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP組成的dNTP?混合物?4?μl???????????????????????????????

濃度為10μM的引物P1???????????????????????????????4?μl?

濃度為10μM的引物P2???????????????????????????????4?μl

濃度為5U/μl的高保真DNA聚合酶???????????????????0.5μl

滅菌水???????????????????????????????????????????32.5μl。