[發明專利]一種低產蛋白酶A的啤酒酵母的篩選方法

無效

• 申請號: 200910036880.7
• 申請日: 2009-01-22
• 公開（公告）號: CN101481661A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 王德良;李惠萍;李琳;宋緒磊;孔祥誠
• 申請（專利權）人: 廣州珠江啤酒股份有限公司
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C12C11/00;C12R1/645
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 李德魁

技術領域

本發明涉及一種低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，屬于生物與發酵工程領域。

背景技術

純生啤酒的泡沫穩定性衰減問題已成為其質量保證的難題，同時又是世界范圍內的研究重點。由于純生啤酒是不經過熱處理而采用物理方式除菌，所以純生啤酒中含有啤酒酵母自身分泌的蛋白酶A，其可能消化有助于啤酒泡沫穩定性的蛋白質，同時產生沒有起泡性能的多肽，導致最終成品啤酒中泡沫穩定性變弱。蛋白酶A對啤酒泡沫的負面影響已經引起國內外許多研究者的研究興趣，尤其在國內純生啤酒高速發展的情況下，殘留在啤酒中的蛋白酶A的活性問題更引起人們的重視。

通過以下三種途徑可以降低蛋白酶A對純生啤酒泡沫的影響：第一種途徑是工藝控制，限制酶的產生和分泌。酵母在處于不利的生理條件下時蛋白酶A分泌會增多，例如氮缺乏、高乙醇濃度、高二氧化碳含量、高的滲透壓。控制好這些工藝條件，可以有效地降低蛋白酶A在發酵液中的活性，從而減少在成品酒中的活性。第二種途徑是用抑制劑對啤酒進行后修飾。通過添加酵母蛋白酶A的抑制劑抑制發酵結束后已分泌的蛋白酶A活力，從而降低蛋白酶A在貨架期對啤酒泡沫穩定性的影響，例如，中國發明專利申請CN101298586A所公開的一種降低啤酒發酵過程中蛋白酶分泌量的方法。第三種途徑是通過遺傳育種的方法選育低產蛋白酶A啤酒酵母菌株，主要包括基因工程技術及誘變育種、雜交育種等方法，例如，中國發明專利申請CN1948462A所公開的一種啤酒酵母工程菌及其制備方法與應用。通過工藝控制，增加工藝來實現對酵母分泌蛋白酶A活性的控制，增耗人力物力。通過添加抑制劑降低蛋白酶A活性，目前的研究還比較少，并不是很成熟。在啤酒釀造時，只有選用產蛋白酶A活性低的酵母菌株，才能從根本上解決純生啤酒泡沫衰減問題。因此選育低產蛋白酶A菌種對于改善純生啤酒泡沫性能至關重要。

無論是應用常規的物理和化學誘變方法還是通過基因工程的方法，最終都將涉及到從改造后的菌株中分離出低產蛋白酶A菌株的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法。蛋白酶A是酵母中目前所知的唯一一種在酸性pH范圍內水解酸變性血色素(acid-denatured?hemoglobin)的酶，本發明利用蛋白酶A的這一特性從大量的誘變菌中篩選出產蛋白酶A低的酵母菌落，從而將上游的菌株改造技術與最終的菌株分離獲得結合起來，在菌體經過改造處理后，快速地分離獲得目的菌株，減少選育過程的盲目性，增強預見性，提高育種效率。

本發明所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，包括以下步驟：

(1)將被篩選啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28℃培養2-3天；

(2)挑選生長旺盛的菌落接種至甘油平板，28℃培養3天，激活蛋白酶A活性；

(3)將酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，37℃放置2-3天；

(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平鋪，根據水解圈大小判斷蛋白酶A的酶活高低，將水解圈小的菌株篩選出來，獲得要篩選的目標菌株。

其中，所述YPD平板的成分為：2％(w/v)葡萄糖；2％(w/v)蛋白胨；1％(w/v)酵母浸粉；2％(w/v)瓊脂。所述甘油平板的成分為：2％(w/v)甘油；1％(w/v)蛋白胨；1％(w/v)酵母浸粉；2％(w/v)瓊脂。所述酸變性血紅蛋白覆蓋液的成分為：1.5％(w/v)瓊脂；0.3％(w/v)，pH值為3.0的酸變性血紅蛋白；0.22％(v/v)Triton?X-100；0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液。所述三氯醋酸的濃度為10％(v/v)，添加量優選為1-2ml。

所述酸變性血紅蛋白覆蓋液通過以下步驟制得：

A.配制0.1M，pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液；

B.配制3％(w/v)的血紅蛋白溶液，用4M的HCl溶液調節pH值至1.0，放置1.5小時并同時在紫外燈下照射30-40分鐘后，用0.1M的NaOH溶液調節pH值至3.0，然后用步驟A所制得的甘氨酸-鹽酸緩沖液進行稀釋，制得1％(w/v)，pH值為3.0的酸變性血紅蛋白溶液；

C.配制0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液，121℃下滅菌15min；

D.將瓊脂粉、Triton-X100溶解于0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液中，煮沸至瓊脂溶解，然后冷卻(但不要凝固)；

E.將步驟B所制得的酸變性血紅蛋白溶液與步驟D所制得的混合溶液按照體積比為3∶7的比例混合均勻。