[發明專利]一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法

無效

• 申請號: 200910035992.0
• 申請日: 2009-10-15
• 公開（公告）號: CN101705271A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 鮑杰;辛秀娟;段梅莉;朱月珍;陸雅臣;俞宏峰
• 申請（專利權）人: 江蘇華榮生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12N9/12;C12N15/70;C12R1/125;C12R1/865;C12R1/19
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1.一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，具體步驟為：

(a)脫氧鳥苷酸激酶的克隆，表達和純化；

(b)丙酮酸激酶的克隆，表達和純化；

(c)用激動劑脫氧腺苷三磷酸，磷酸烯醇式丙酮酸和游離的脫氧鳥苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧鳥苷單磷酸合成脫氧鳥苷三磷酸；包括以脫氧鳥苷單磷酸為原料進行的脫氧鳥苷三磷酸的生物催化合成；該過程由兩步耦合的磷酸化反應經生成中間產物脫氧鳥苷二磷酸實現，其中用到原料為可溶性的脫氧鳥苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶，在第一步中，使用脫氧腺苷三磷酸為磷酸供體，而在第二步反應中，磷酸供體為磷酸烯醇式丙酮酸。

2.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(a)中，所述的脫氧鳥苷酸激酶的克隆是指：包含了釀酒酵母的培養，基因組DNA的提取，利用PCR技術從中獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內的完整的脫氧鳥苷單磷酸激酶的基因URA6，然后利用粘性末端連接法，進行重組質粒pET-17b/URA6的成功構建，以及該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并成功地進行高效表達。

3.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(a)中，所述的脫氧鳥苷酸激酶的表達和純化是指：利用2～3mg/ml的細菌溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細鳥，然后使用蛋白分子量截留為3,500～14,000?Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化。

4.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(b)中，所述的丙酮酸激酶的克隆是指：自枯草桿菌中獲得丙酮酸激酶的基因BYK，重組質粒pET-28a/byk的成功構建，以及該質粒順利轉入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并成功地進行高效表達。

5.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(b)中，所述的丙酮酸激酶的表達和純化是指：利用溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞，使用蛋白分子截留量在3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化。

6.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(c)中，所述的第一步反應是指：在可溶性脫氧鳥苷單磷酸激酶的作用下一摩爾的脫氧鳥苷單磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸轉變為一摩爾的脫氧鳥苷二磷酸和一摩爾的脫氧腺苷二磷酸。

7.如權利要求1所述的一種通過生物技術合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步驟(c)中，所述的第二步反應是指：一摩爾的脫氧鳥苷二磷酸和一摩爾的脫氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴隨著磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉化，脫氧鳥苷二磷酸轉化為脫氧鳥苷三磷酸同時脫氧腺苷二磷酸也被轉化為脫氧腺苷三磷酸，此時生成的脫氧腺苷三磷酸又可以再次作為第一步反應的磷酸供體，參與第一步反應。