[發(fā)明專利]一種通過生物技術(shù)合成脫氧鳥苷三磷酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910035992.0
• 申請日: 2009-10-15
• 公開（公告）號: CN101705271A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發(fā)明（設計）人: 鮑杰;辛秀娟;段梅莉;朱月珍;陸雅臣;俞宏峰
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇華榮生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12N9/12;C12N15/70;C12R1/125;C12R1/865;C12R1/19
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【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及脫氧鳥苷三磷酸技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種通過生物技術(shù)合成脫氧鳥苷三磷酸的方法。

【背景技術(shù)】

DNA分子是由四種脫氧核糖核苷酸分子結(jié)合成的兩條互補多聚核苷酸鏈。合成這些多聚核苷酸的前體是四種脫氧核苷三磷酸，脫氧鳥苷三磷酸作為四種原料之一參與核酸分子的體內(nèi)或體外擴增。隨著生物技術(shù)工業(yè)的發(fā)展特別是DNA生物合成和聚合酶鏈式反應的推廣，市場上對DNA擴增所需要的脫氧核苷三磷酸的需求量將會明顯地持續(xù)升高。另外，由于脫氧鳥苷三磷酸在抗病毒抗腫瘤，治療心血管疾病等方面應用的推廣，同樣也會對包括本發(fā)明所闡述的產(chǎn)品-脫氧鳥苷三磷酸的需求量的提高起到促進作用。

目前，商業(yè)化的脫氧鳥苷三磷酸產(chǎn)品主要是由化學合成法實現(xiàn)的(Chamberset?al.，1957；Smith?and?Khorana，1958)；其中，脫氧鳥苷三磷酸的合成方法包括使用脫氧鳥苷單磷酸的三正丁基銨鹽與正磷酸在二環(huán)己基碳二亞胺的存在下，在吡啶或二甲基甲酰胺水溶液中進行反應。脫氧鳥苷單磷酸的轉(zhuǎn)化率為71％；而且在轉(zhuǎn)化過程中不可避免地會生成脫氧鳥苷二磷酸和脫氧鳥苷多磷酸等主要副產(chǎn)物。因此在后續(xù)的分離中，需要色譜分離方法實現(xiàn)脫氧鳥苷單磷酸與脫氧鳥苷二磷酸和脫氧鳥苷三磷酸的分離。提純過程還需要除去未反應的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和正磷酸、副產(chǎn)物脫氧鳥苷單磷酸、二磷酸和多磷酸以及還原后的DCC、吡啶或DMF溶劑。在化學轉(zhuǎn)化法所用溶劑屬于美國環(huán)境保護署列出的有毒化學品。

中國專利申請?zhí)?0100844中公開了一種通過酶催化和化學反應聯(lián)合生產(chǎn)脫氧核苷三磷酸的方法；該方法以天然DNA為起始原料，DNA經(jīng)酶解后，脫氧核苷單磷酸經(jīng)“脫氧核苷單磷酸酶的催化”反應和相應的化學反應后轉(zhuǎn)化為包括脫氧鳥苷三磷酸產(chǎn)品在內(nèi)的四種脫氧核苷三磷酸；在該方法中，發(fā)明者沒有對這種“脫氧核苷單磷酸酶”進行具體描述；這種酶的名字也沒有被NC-IUBMB(國際生物化學和分子生物學聯(lián)合命名委員會http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/)酶命名法收錄和接受，其中的化學法就是上文中所提到的方法。

中國專利申請?zhí)?2134612公開了一種三磷酸脫氧核苷的生產(chǎn)方法；該方法是將核苷酸還原酶EC1.17.4.2和要轉(zhuǎn)化的底物腺苷三磷酸或鳥苷三磷酸或鳥苷三磷酸或胸苷三磷酸加入到反應系統(tǒng)中，使酶的濃度達0.01～0.16單位/ml，使底物濃度達到1～60mmol/L，并加入以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶，以及含巰基還原劑或NADH或蛋白質(zhì)還原劑，以緩沖液控制溶液pH6～9，于25℃～40℃反應；在該過程中必須使用維生素B-12作為輔酶，以NADH或蛋白作為還原劑。工藝路線與本專利不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過生物技術(shù)合成脫氧鳥苷三磷酸的方法.

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種通過生物技術(shù)合成脫氧鳥苷三磷酸的方法，其特征在于，具體步驟為：

(a)脫氧鳥苷酸激酶的克隆，表達和純化；

脫氧鳥苷酸激酶的克隆是指：包含了釀酒酵母的培養(yǎng)，基因組DNA的提取，利用PCR技術(shù)從中獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的完整的脫氧鳥苷單磷酸激酶的基因URA6，然后利用粘性末端連接法，進行重組質(zhì)粒pET-17b/URA6的成功構(gòu)建，以及該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并成功地進行高效表達；

脫氧鳥苷酸激酶的表達和純化是指：利用2～3mg/ml的細菌溶菌酶加表面活性劑(如0.5％Tween20和0.5％的P450)或超聲波破碎細胞，然后使用蛋白分子量截留為3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化；

(b)丙酮酸激酶的克隆，表達和純化；

丙酮酸激酶的克隆是指：自枯草桿菌中獲得丙酮酸激酶的基因BYK，重組質(zhì)粒pET-28a/byk的成功構(gòu)建，以及該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并成功地進行高效表達；

丙酮酸激酶的表達和純化是指：利用溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞，使用蛋白分子截留量在3,500～14,000Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶，或者通過色譜柱進行進一步的純化；

(c)用激動劑脫氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游離的脫氧鳥苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧鳥苷單磷酸合成脫氧鳥苷三磷酸；