[發(fā)明專利]羅丹明B人工抗原及其制備方法和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910035980.8
• 申請日: 2009-10-15
• 公開（公告）號: CN101671391A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發(fā)明（設計）人: 沈萍萍;徐加發(fā)
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/113;C07K16/44;G01N33/545
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術領域

本發(fā)明屬于免疫學技術領域，具體涉及羅丹明B人工抗原的制備方法及其應用。

二、背景技術

羅丹明B(Rhodamine?B)俗稱玫瑰紅，花粉紅，是一種鄰苯二酚類的堿性熒光染料，由于其具有很好的熒光性質，目前已廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測、有色玻璃、特色煙花爆竹和生物學染色等領域。羅丹明B的結構如圖一所示。

近些年來，實驗研究表明：羅丹明B可以明顯減少人纖維原細胞的數(shù)量，抑制其增殖；同時，它還可以抑制人血管內皮細胞和平滑肌細胞的增殖。另外，經動物試驗發(fā)現(xiàn)：羅丹明B能引起皮下組織生肉瘤，具有潛在的致癌和致突變能力。歐美等國家和地區(qū)從1993年起明令禁止其在食品加工中使用。我國衛(wèi)生部也在2008年將其列入首批食品中可能違法添加的非食用物質名單之中。

但是由于其價廉易得、色澤鮮亮持久等特點，仍然有一些不法食品生產、加工商違規(guī)、違法使用羅丹明染料。這一方面給國家的食品安全帶來了很大的隱患；另一方面，也給消費者的身心健康帶來嚴重威脅。

目前，國內外對食品中羅丹明B的常用檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、高效液相-質譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。但是由于色譜法的樣品前處理復雜繁瑣，需要精密昂貴的檢測器和質譜等儀器設備，同時還要有專門的技術人員操作儀器，很難達到快速、便捷的現(xiàn)場檢測要求，因此限制了其在許多檢測機構尤其是基層檢測部門的大規(guī)模推廣使用。

酶聯(lián)免疫檢測分析(Enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)由于具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，近些年來備受人們的關注。免疫分析是以抗體作為生物檢測器的分析技術，而羅丹明B作為小分子物質，分子量為479，是半抗原，本身不具有誘導產生抗體的能力，不能直接通過它免疫動物而得到檢測所必須的抗體，因此，合成羅丹明B的人工抗原便成為建立其ELISA分析方法的首要步驟和關鍵所在。

從羅丹明B分子結構中可以看出：它本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基團。本發(fā)明將羅丹明B分子直接以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原。

三、發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是：

本發(fā)明主要是利用羅丹明B分子結構本身含有的活性基團---羧基，為羅丹明B提供了一種人工抗原簡單的制備方法。

本發(fā)明的技術方案是：

本發(fā)明所述的羅丹明B人工抗原為載體蛋白直接與羅丹明B分子中的羧基通過脫水縮合形成酰胺鍵而得，其結構如圖1。將羅丹明B以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原。

羅丹明B人工抗原的合成：

1、將羅丹明B(96mg，200uM)、DCC(41.2mg，200uM)、NHS(46mg，400uM)按1∶1∶2的摩爾比混合，溶解于400ul經無水處理的DMF中，室溫密封攪拌過夜；

2、將混合液1000rpm，離心5分鐘，后吸取上層反應液，將其緩慢逐滴加入到冰浴的10uM的BSA溶液中，4℃攪拌反應過夜；

3、將反應液轉移至透析袋中，以PBS為透析液4℃透析7天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的羅丹明B等雜質；

4、透析結束后，將反應液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。

羅丹明B人工抗原作為免疫原來分別免疫雄性新西蘭大白兔和雌性Balb/c小鼠，可分別制備出多克隆抗體和單克隆抗體，作為包被抗原可運用于免疫分析。

羅丹明B人工抗原的合成路線見圖2。

本發(fā)明與已有技術相比其有益效果是：

目前所報道的羅丹明B人工抗原的制備方法中，主要是通過對羅丹明B的類似物---羅丹明123中的活性基團氨基進行修飾偶聯(lián)而來。雖然羅丹明123與羅丹明B的結構相似，都具有苯環(huán)部分和羧基部分，但是與羅丹明B相比，羅丹明123結構中苯環(huán)上所連接的是氨基，而不是兩個乙基，這樣就導致了其空間結構在這一區(qū)域有著很大的不同；另一方面，由于羅丹明123結構中帶有兩個氨基而直接引起了兩種物質帶電情況具有很大的區(qū)別，這兩方面的原因可能直接導致抗原決定簇的改變和抗原遞呈細胞對羅丹明B的識別和遞呈能力，最終導致產生的抗體具有很大的差異。本發(fā)明的優(yōu)勢在于我們根據(jù)羅丹明B自身帶有活性基團這一特點，不改變它的結構，直接對其進行與載體的偶聯(lián)反應，從而最大程度上保持了結構的穩(wěn)定性，因此將其免疫動物后有助于提高抗體的質量。

四、附圖說明