[發明專利]羅丹明B人工抗原及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910035980.8
• 申請日: 2009-10-15
• 公開（公告）號: CN101671391A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 沈萍萍;徐加發
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/113;C07K16/44;G01N33/545
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 胡錫瑜

1、一種羅丹明B的人工抗原，其特征在于結構為：

其中，載體蛋白直接與羅丹明B分子中的羧基通過脫水縮合形成酰胺鍵而共價偶聯。

2、根據權利要求1所述羅丹明B人工抗原的合成方法，其特征在于合成步驟為：

(1)將羅丹明B96mg、DCC?41.2mg、NHS?46mg按1∶1∶2的摩爾比混合，溶解于400ul經無水處理的DMF中，室溫密封攪拌過夜；

(2)將混合液1000rpm，離心5分鐘，后吸取上層反應液，將其緩慢逐滴加入到冰浴的10uM的BSA溶液中，4℃攪拌反應過夜；

(3)將反應液轉移至透析袋中，以PBS為透析液4℃透析7天，每12小時換一次透析液，以除去未反應的羅丹明B等雜質；

(4)透析結束后，將反應液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。

3、根據權利要求2所述羅丹明B人工抗原合成方法，其特征是偶聯劑為N，N-二環己基碳二亞胺或1-乙基-3-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺或N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)。

4、根據權利要求2所述一種羅丹明B人工抗原合成方法，其特征在于載體蛋白可以為牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血藍蛋白或人血清白蛋白或兔血清白蛋白。

5、根據權利要求1所述羅丹明B人工抗原，其特征在于作為免疫原來分別免疫雄性新西蘭大白兔和雌性Balb/c小鼠，可分別制備出多克隆抗體和單克隆抗體。

6、根據權利要求1所述一種羅丹明B人工抗原，其特征在于可作為包被原用于ELISA的免疫分析，步驟為：

(1)照板：將聚苯乙烯微孔板置于紫外燈下照射6小時左右；

(2)抗原包被：抗原濃度按1∶200，1∶400，1∶600，1∶800，1∶1000的梯度稀釋，不同濃度可根據具體情況而定，100ul/孔，4℃過夜；

(3)洗板：PBST洗滌，2分鐘/次，洗5次；

(4)封閉：1％明膠封閉，200ul/孔，37℃放置2小時；

(5)洗板：PBST洗滌，2分鐘/次，洗5次；

(6)樣品檢測：加入血清，稀釋度一般為1∶1000，1∶10000，1∶20000，1∶50000，1∶100000，不同濃度可根據具體情況而定，100μl/孔，同時做陽性對照，37℃放置2小時；

(7)洗板：PBST洗滌，2分鐘/次，洗5次；

(8)二抗：二抗用PBST稀釋，稀釋度為1∶10000，100μl/孔，37℃放置1小時；

(9)洗板：PBST洗滌，2分鐘/次，洗5次；

(10)顯色：加入可溶性TMD底物，100μl/孔，37℃放置25分鐘；

(11)終止：加入2mol/L硫酸終止反應，50μl/well；

(12)讀數：在測定波長為450nm，參比波長為650nm條件下測定吸光值。