[發明專利]一種側面組裝的金納米棒標記抗體定量檢測氨芐青霉素的方法

無效

• 申請號: 200910035792.5
• 申請日: 2009-10-16
• 公開（公告）號: CN101699286A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發明（設計）人: 胥傳來;朱穎越;陳偉;徐麗廣;馬偉;彭池方
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/531;G01N15/02
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種側面組裝的金納米棒標記抗體定量檢測氨芐青霉素的方 法，屬于免疫檢測技術領域。

背景技術

氨芐青霉素是半合成的青霉素，是在青霉素G側鏈羧基的α位引入氨基，改 變了它的極性，使其更容易透過細菌細胞膜，擴大了抗菌譜，結構為：

氨芐青霉素耐酸不耐酶，內服或肌肉注射均易吸收，對大多數革蘭氏陽性 菌的效力不如青霉素。特點是對革蘭氏陰性菌，如大腸埃希菌、變形桿菌、沙 門菌等均有較強的作用。同時它具有耐酸的特征，避免了天然青霉素不宜內服 的缺點，這就為臨床給藥提供了很大的方便，在臨床上得以廣泛應用。主要用 于上述敏感菌所致的呼吸道感染、胃腸道感染、尿路感染、軟組織感染、腦膜 炎、敗血癥、心內膜炎等。氨芐青霉素臨床不良反應主要以過敏性皮疹、過敏 性休克和胃腸道反應為主。氨芐青霉素是治療奶牛和其他食用動物疾病的常用 藥物之一，殘留在動物性食品中的氨芐青霉素類藥物會對人體、環境造成巨大 的危害，目前迫切需要開發快速、廉價、易于操作的檢測方法對其進行檢測。

當今國際上常用的氨芐青霉素殘留檢測的方法有：微生物法、色譜法、免 疫分析法等。微生物檢測的靈敏度不高且時間消耗長，而儀器分析方法不僅需 要昂貴的儀器設備，對操作人員的要求也比較高，需要經過復雜的樣品前處理 才能進行。國外早已經開展了對氨芐青霉素抗生素免疫分析方法的研究，常用 的方法為酶聯免疫分析法(ELISA)、放射免疫法(RIA)和熒光免疫測定法(FIA 等)，其中ELISA最為常用，這類方法是將包被原包被酶標板，加入藥物及抗藥 物抗體，再加入酶標二抗，即檢測抗體，最后加入底物顯色，一定時間后，用 酶標儀檢測某一特定波長的吸光度值，根據已知標準品含量計算樣品中待測藥 物的濃度，此操作也存在繁瑣，費時的缺點。

激光粒度儀(Dynamic?light?scattering，DLS)技術由于可以用來對膠體、納米 顆粒和蛋白質進行的快速檢測，通過測量其尺寸、多分散性以及zeta電位，優 化其穩定性與儲存能力，判斷蛋白質是否聚集；篩選最優化的結晶條件；并可 對僅2μL的樣品進行寡聚物研究，僅需幾納克的原料物質。對于金納米棒而言， 其組裝的大小可以用激光粒度儀來測定。國內目前為止尚未見有利用金納米棒 的激光粒度儀的信號達到對體外目標物檢測的報道，本發明彌補了這一空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有高靈敏性、特異性、準確度、操作方法簡單 并快速的金納米棒標記抗體側面組裝的免疫檢測方法，用于氨芐青霉素殘留的 快速檢測。

本發明的技術方案：一種側面組裝的金納米棒標記抗體定量檢測氨芐青霉 素的方法，首先分別將氨芐青霉素抗體及包被原修飾到金納米棒上去，再加氨 芐青霉素標準品或待測上清液，氨芐青霉素標準品與包被原競爭修飾在金納米 棒上的抗體，隨著加入的氨芐青霉素標準品的量的不同，所形成的抗體與包被 原的金納米棒的側面組裝的免疫聚合物的粒徑大小不同，由此用激光粒度儀進 行檢測而完成對含氨芐青霉素待測樣品的檢測；步驟為：

(1)氨芐青霉素抗體及包被原與金納米棒的偶聯：

a.抗體與金納米棒偶聯：0.5mL、100μg/mL的氨芐青霉素抗體逐滴加入用 0.1mol/L的碳酸鉀預調至pH?8.5-8.8、0.5mL、2n?mol/L金納米棒溶液中，室溫 震蕩混勻，37℃反應1h，反應結束6000rpm離心20min，去除未結合的抗體， 重懸在pH?7.4、含0.5％聚乙二醇PEG20000的0.01mol/L的PBS中，制得氨芐青 霉素抗體修飾的金納米棒探針；

b.包被原與金納米棒偶聯：0.5mL、100μg/mL的氨芐青霉素包被原逐滴加 入用0.1mol/L的鹽酸預調至pH?5、0.5mL、2n?mol/L的金納米棒溶液中，室溫 震蕩混勻，37℃反應1h，反應結束6000rpm離心20min，去除未結合的包被原， 重懸在pH?7.4、含0.5％PEG20000的0.01mol/L的PBS中，制得氨芐青霉素包被 原修飾的金納米棒探針；

(2)金納米棒側面組裝