[發明專利]一種耐熱角質酶-CBD的制備及其在棉纖維精練中的應用

有效

• 申請號: 200910033667.0
• 申請日: 2009-06-05
• 公開（公告）號: CN101591648A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 吳敬;陳堅;張瑤;陳晟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N15/55;C12N15/70;D06M16/00;C12R1/19;D06M101/06
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種耐熱角質酶-CBD基因的制備，及其在棉纖維精練中的應用，屬于酶基因工程和酶工程領域。

背景技術

在棉織物精練過程中，為了使棉纖維獲得優良的潤濕性和白度，需要去除嚴重影響棉織物外觀、服用性能和染整加工的角質、棉蠟、果膠質和蛋白質等各種伴生物。目前國內一直采用傳統的強堿高溫處理方法，它存在許多不足之處，流程復雜冗長，設備龐大、纖維損傷大，水耗和能耗大，產生大量污水，對生態環境極為不利等。隨著社會對紡織品和環境的環保問題日益重視，酶用于紡織中，易于生物降解，不會污染環境與紡織品。用酶對棉織物進行前處理是國內外公認的21世紀的環保型染整技術。今后對紡織專用酶制劑的需求必將逐漸增大，推廣應用前景廣闊。

角質酶可分解棉纖維表面的角質，并將附著的脂質等雜質一同從棉纖維表面除去，同時對棉籽殼也有一定的降解作用，可提高原棉的潤濕性；與果膠裂解酶具有較好的協同效應，能更好地去除角質層、果膠層，保證織物的良好紡織性能；與其他紡織酶制劑復合使用可實現紡織的綠色加工。角質酶在紡織行業具有較強的應用潛力。

纖維素結合域(cellulose-binding?domain，CBD)在結構上和功能上都是纖維素酶獨立的結構域，能夠提高底物在酶周邊的濃度或破壞底物多糖結構進而增強了酶催化能力。CBD作為最普遍的結構組成已有大量數據顯示與酶和纖維素的有效結合密切相關，尤其對結晶纖維素的降解是必須的。CBD對于提高酶與纖維的可及度，增強纖維素酶解效率，揭示纖維素酶解過程具有重要意義。將CBD與精練用酶(如角質酶)融合可以增加酶對棉纖維的結合能力，從而更好地水解棉纖維表面雜質，這種提高角質酶催化效率的分子改造策略目前國內外未見報道。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種耐熱的角質酶-CBD，其具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

本發明的另一個目的是提供一種編碼本發明的耐熱角質酶-CBD的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

本發明的再一個目的是提供包含本發明基因的表達載體。

本發明的又一個目的是提供包含本發明表達載體的宿主細胞。

本發明的技術方案：一種耐熱角質酶-纖維素結合域融合酶，縮寫為耐熱角質酶-CBD，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

所述的耐熱角質酶-CBD的基因，它具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

所述的耐熱角質酶-CBD基因的表達方法：以pET20b-Tfu_0883質粒DNA及嗜熱子囊菌(Thermobifida?fusca)WSH03-11總DNA為模板，設計引物分別PCR得到編碼角質酶Tfu_0883的基因及纖維素酶Tfu_1074中CBD的基因，再通過重疊PCR獲得編碼角質酶-CBD的融合基因SEQ?ID?NO：1。角質酶-CBD基因以質粒pET20b(+)為表達載體，以E.coli?BL21(DE3)為表達宿主，實現耐熱角質酶-CBD基因的高效表達；

(1)Thermobifida?fusca?WSH03-11總DNA的提取：

Thermobifida?fusca?WSH03-11菌株(該菌株巳在【化工進展】2006年第25卷第5期公開)，在LB液體培養基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl?10g/L)中50℃培養2天，取3mL菌液12000rpm離心收集菌體，按照北京博大泰克細菌基因組DNA提取試劑盒方法提取Thermobifida?fusca?WSH03-11總DNA；

(2)耐熱角質酶-CBD編碼基因的克隆：

根據NCBI上登錄的Tfu_0883及Tfu_1074的基因序列分別設計兩對引物P1、P2和P3、P4。下劃線為酶切位點NcoI和EcoRI，

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’