[發明專利]一種耐熱角質酶-CBD的制備及其在棉纖維精練中的應用

有效

• 申請號: 200910033667.0
• 申請日: 2009-06-05
• 公開（公告）號: CN101591648A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 吳敬;陳堅;張瑤;陳晟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N15/55;C12N15/70;D06M16/00;C12R1/19;D06M101/06
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種耐熱角質酶-纖維素結合域融合酶，縮寫為耐熱角質酶-CBD，其氨基酸序列如SEQ?IDNO：2所示。

2.一種編碼權利要求1所述的耐熱角質酶-CBD的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

3.一種權利要求2所述的耐熱角質酶-CBD基因的表達方法，其特征是以pET20b-Tfu_0883質粒DNA及嗜熱子囊菌(Thermobifida?fusca)WSH03-11總DNA為模板，設計引物分別PCR得到編碼角質酶Tfu_0883基因及纖維素酶Tfu_1074中CBD的基因，再通過重疊PCR獲得編碼耐熱角質酶-CBD的融合基因SEQ?ID?NO：1，以pET20b(+)為表達載體，以E.coli?BL21(DE3)為表達宿主，實現了耐熱角質酶-CBD基因的高效表達；步驟為：

(1)Thermobifida?fusca?WSH03-11總DNA的提取：

Thermobifida?fusca?WSH03-11菌株在LB液體培養基中50℃培養2天，取3mL菌液12000rpm離心收集菌體，按照北京博大泰克細菌基因組DNA提取試劑盒方法提取Thermobifida?fusca?WSH03-11總DNA；

(2)耐熱角質酶-CBD編碼基因的克隆：

根據NCBI上登錄的Tfu_0883及Tfu_1074的基因序列分別設計兩對引物P1、P2和P3、P4，下劃線為酶切位點NcoI和EcoRI，

P1：5’-GGAATACCATATGTCCATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’

P2：5’-CGCGGCGATCGCCATGAACGGGCAGGTGGA-3’

P3：5’-TCCACCTGCCCGTTCATGGCGATCGCCGCG-3’

P4：5’-CATCTCGAGAGAATTCGGGCAGGTAAGGGTCGGAACAG-3’

以pET20b-Tfu_0883質粒DNA為模板，以P1、P2為引物，PCR擴增角質酶的基因；以Thermobifida?fusca?WSH03-11總DNA為模版，以P3、P4為引物，PCR擴增纖維素酶CBD的基因；PCR反應在50μL體系中參照TaKaRa?Ex?Taq^TM試劑盒的方法進行，反應條件為在95℃變性5min后開始循環，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35個循環后，再于72℃延伸10min；分別擴增得到780bp與381bp的PCR片段，割膠回收；然后再以角質酶基因與CBD基因PCR割膠回收片斷為模板，以P1、P4為引物，再進行PCR反應；擴增得到1161bp的PCR片段，割膠回收；回收片段與pMD18-T?simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板；經37℃培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8～10h后提取質粒，命名為Tfu_0883-CBD/pMD18-T?simple，將此質粒進行序列測定；

(3)耐熱角質酶-CBD基因在大腸桿菌表達載體上的構建：?

用于構建大腸桿菌表達載體的質粒是pET20b(+)，帶有pelB信號肽和His-tag標記，將pET20b(+)質粒與耐熱角質酶-CBD基因進行NcoI和EcoRI雙酶切，酶切產物割膠回收后，用T4連接酶16℃連接過夜，連接產物轉化E.coli?JM109感受態細胞，37℃培養過夜，挑選轉化子在含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中進行液體培養，然后提取質粒，得富集的Tfu_?0883-CBD/pET20b(+)質粒；

(4)大腸桿菌宿主轉化和篩選重組菌：

將質粒Tfu_0883-CBD/pET20b(+)轉化E.coli?BL21(DE3)宿主菌，再在含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上經37℃培養過夜，挑選轉化子重組菌Tfu_0883-CBD/pET20b(+)/E.coli?BL21(DE3)在LB培養基中37℃液體培養過夜，后接入TB發酵液體培養基，25℃培養48h時產酶達40U/mL；

(5)耐熱角質酶-CBD的純化：

將步驟(4)所得耐熱角質酶-CBD發酵液于4℃、10000rpm離心30min除菌體；上清液中加入70％固體硫酸銨鹽析過夜，4℃、10000rpm離心30min，沉淀用含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑，pH?7.4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過0.22μm膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，用含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、0-500mM咪唑，pH?7.4的緩沖液線性梯度洗脫，流速1mL/min，檢測波長為280nm，分部收集含角質酶酶活的洗脫液；活力組分用30000道爾頓膜離心濃縮，得純化耐熱角質酶-CBD酶制品。

4.一種權利要求1所述耐熱角質酶-CBD的應用，其特征是用于棉纖維的精練；耐熱角質酶-CBD具有角質酶活性，最適溫度為50℃，最適pH?8，在50℃下保溫50h，酶活仍達50％以上，耐熱角質酶-CBD對棉纖維的吸附率為50％，6h達到反應平衡，生成180μmol脂肪酸；

(1)耐熱角質酶-CBD對棉纖維的吸附效果：

試樣為10mL反應體系，其中分別加入1mL耐熱角質酶-CBD的酶液、酶活力100U/mL，1mL果膠酶液、酶活力100U/mL，8mL?pH?8.0的25mM磷酸鉀緩沖液，0.5g原棉纖維和50μL滲透劑TX-10；對照樣與不加原棉纖維的上述試樣其它條件一致；在室溫下反應，定時取樣；取出的樣液經離心3min后按照測定酶活的方法測上清液中酶活；被吸附的酶量為對照樣溶液中的酶活減去上清液中的酶活；

(2)耐熱角質酶-CBD對棉纖維的精練效果：

試樣為10mL反應體系，其中加入0.5g原棉纖維，8mL?pH?8.0的25mM磷酸鉀緩沖液，1mL耐熱角質酶-CBD酶液、酶活力100U/mL，1mL果膠酶液、酶活力100U/mL和50μL滲透劑TX-10，在50℃保溫，不同時間取樣，用0.02mol/LNaOH溶液滴定生成的脂肪酸。?