[發明專利]可二次驗證堿基信息的DNA測序方法

有效

• 申請號: 200910033400.1
• 申請日: 2009-06-19
• 公開（公告）號: CN101575639B
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 陸祖宏;羅俊峰;白云飛;肖鵬峰;呂華
• 申請（專利權）人: 無錫艾吉因生物信息技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/76
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術領域

本發明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法涉及的是一種能夠原位清除延伸標記物， 能夠二次驗證同一個堿基位置的信息，同時保護引物延伸末端完整，通過逐步合成鑒定未 知堿基DNA測序方法，屬于生物技術領域。

技術背景

被稱為第三大科學計劃的人類基因組計劃于20世紀80年代啟動，這個由多個國家參 加的計劃的完成對人類認識自身，提高健康水平，推動生命科學、醫學、生物技術、制藥 業、農業等的發展具有極其重要的意義。2000年6月26日，人類基因組工作草圖由美國、 英國、法國、德國、日本和中國科學家宣布基本完成，2002年2月又公布了“精細圖”。人 類基因組計劃的實施期間，科學家還完成了大鼠、小鼠、水稻等物種的測序。眾多物種的 基因組序列和大量的基因被識別，后基因組時代便是要對這些基因的結構、功能、表達和 分布進行深入的研究，因此，急需高通量、大規模的分析手段和方法來解決這些需求。20 世紀90年代建立起來的基因芯片技術和最近發展起來的第二代DNA測序技術是高通量研 究基因的結構和功能的兩種比較重要的技術，推動了功能基因組和系統生物學研究的發 展。

目前用于最為廣泛應用的測序技術是Sanger等(1977)發明的雙脫氧鏈末端終止法， Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到 摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有 所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處 終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整， 使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同 的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光 膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。最近幾年發展起來的高通量測序技術結合基因 芯片技術，可以一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，被科學家稱為下一代 測序技術(next?generation?sequencing)，同時高通量測序技術使得對一個物種的轉錄組和基 因組進行細致全面的相關性分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep?sequencing)。目 前，高通量測序平臺的代表是羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roch?GS?FLX?sequencer)， Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina?Genome?Analyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABI SOLiD?sequencer)。Sanger測序法，454焦磷酸測序法和Solexa測序法其技術本質都是合成測 序，合成測序方法通過把大量被測的模板DNA片段進行固定，并在固定化的DNA測序模板 上雜交結合通用的DNA引物，分別控制4種堿基在DNA引物上的延伸。通過檢測延伸反應 過程或所延伸的堿基，實現高通量并行的DNA序列信息的檢測。在合成測序策略中，測序 引物首先和待測序的DNA模板結合，然后依次加入4種脫氧核苷酸，引物以被測DNA片段 為模板，在DNA聚合酶的催化下逐步延伸。此過程中，有多種方法可以用來確定引物是否 發生延伸反應，并根據所加入的相應的脫氧核苷酸種類，確定DNA模板上的堿基信息。通 過4種脫氧核苷酸循環加入，或者按照指定的順序加入，最終獲取所需要的核酸閱讀長度。 Solid測序技術較為特別，它使用的連接測序法，用已知的寡聚核苷酸片段代替核苷酸，用 DNA連接酶代替DNA聚合酶。Sanger法的優勢在于可以分析未知的DNA序列，而且單向反 應的讀序能力較長，目前的技術可以達到1000bp以上，然后，在實際工作中，很多情況需 要對已知序列的DNA片段進行序列驗證或是對為數不多的位點進行分析驗證，在這種情況 下，較短序列的高通量測序方法更為適用。測序技術可以在多個領域進行應用，在分子診 斷學方面，可以用于病原微生物的快速鑒定，遺傳病分子診斷(如SNPs，SNP等位頻率)， 在法醫鑒定方面，如對線粒體D-Loop區的HVI和HVII高可變區進行分析，在藥物基因組學 方面，如瑞典Eurona?Medical?AB與Pyrosequencing公司合作對血管緊張轉換酶(ACE)的SNP 進行分析以及在農業生物方面都有諸多應用?？梢姕y序技術已經越來越受到關注，無不預 示著測序技術在不久的將來，不僅僅是只作為一種科學研究的工具，而且將向一個產業發 展，將更好的為人類健康服務，更貼近人類的生活。