[發明專利]可二次驗證堿基信息的DNA測序方法

有效

• 申請號: 200910033400.1
• 申請日: 2009-06-19
• 公開（公告）號: CN101575639B
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 陸祖宏;羅俊峰;白云飛;肖鵬峰;呂華
• 申請（專利權）人: 無錫艾吉因生物信息技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/76
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

1.一種可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于DNA序列上一個堿基的信息 的確定是通過兩次延伸測序步驟來實現的，該DNA測序過程如下：

步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進行雜交，雜交后用 去離子水清洗；

步驟2)加入第一次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL?DNA聚合酶、四種用熒 光標記的雙脫氧核糖核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的脫氧核苷酸單體A、T、C、G， 用熒光標記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在 上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種，反應完成后用去離子水清洗 并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息；

步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標記核苷酸單體通過生物酶切割方法進行清除， 反應完成后用去離子水清洗；

步驟4)加入第二次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL?DNA聚合酶、四種用熒光 標記的可脫保護的2′位上基團或者2′位上基團修飾的硫代 核苷酸單體A、T、C、G和四種未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G， 用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體和同種類未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸 單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護的硫代核苷酸單體A、 T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息；

步驟5)用化學試劑0.1M的氫氧化鈉溶液或者0.01M的高碘酸鈉溶液去除上述步驟4) 中延伸上的用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上的可脫保護基團，同時去除該硫代 核苷酸單體上的熒光基團；

循環上述步驟2)、3)、4)和5)所進行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信 息。

2.根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的可二 次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式 獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進一步驗證該堿基信息。

3.根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，所述的固定的待測DNA 模板是指待測定序列的DNA片段。

4.根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的步驟 (2)中用熒光標記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種：DAPI、Cy2、 Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa?488、Alexa?568、JOE、ROX、Rhodamine?6G、 Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas?Red、BODIPY?630/650、BODIPY?650/665；所 述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

5.根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的步驟 (4)中所用的熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的 一種：DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa?488、Alexa?568、JOE、ROX、 Rhodamine?6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas?Red、BODIPY?630/650、BODIPY 650/665；所述的硫代核苷酸單體特征在于結構為： 其中，Y為嘌呤堿基基團或者嘧啶堿 基基團，核糖或脫氧核糖基團2′和3′位置上連接著R1和R2基團，在一定條件下，R1 或R2基團可以被分解，形成羥基，R1基團選自但不限于下列化學基團之一：

R2選自但不限于H、OH、羰 基，以及與R1相同的基團；R4，R5和R6分別是：R4選用氫原子或烴基；R5選用氫 原子或烴基；R6選用烴基、環烴基、鏈烯基、環烯基或芐基。

6.根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于在執行權利 要求1所述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)被同時執行1到10次。