[發明專利]一種DNA結合蛋白高靈敏高通量的檢測方法

無效

• 申請號: 200910032411.8
• 申請日: 2009-06-13
• 公開（公告）號: CN101591705A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 潘志強;張勵才;邵翠杰;張成標
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明屬于基于微陣列芯片的DNA結合蛋白檢測技術，特別涉及一種DNA結 合蛋白高靈敏高通量的檢測方法。

背景技術

對于各種生命活動來說，蛋白與DNA的特異性結合是許多細胞表現各種生物 活性的一個關鍵步驟，包括基因轉錄調節、翻譯以及DNA復制、重組和修復等。 因此，DNA結合蛋白的檢測和特異性結合位點的鑒定對于探索基因表達機制和分析 細胞功能是十分重要的。進而，探明這些信息有助于查明生物有機體發育畸變的 原因。近來，DNA結合蛋白以及結合位點信息已經成為許多疾病診斷和藥物發現的 潛在標簽和靶標。實現對相關轉錄因子的早期診斷也是預防與治療眾多疾病如癌 癥、疼痛等的一個重要方法。因此，建立一種監測轉錄因子的轉錄水平或活性的 快速靈敏方法是十分關鍵的。目前常規檢測DNA結合蛋白的方法有蛋白電泳遷移 法、DNA印記法、ELISA法和Southwestern印跡法。然而，這些方法都比較費時 耗力，并且這些方法不是需要放射性標記，就是需要昂貴的抗體，目前現存的檢 測方法都存在不同的技術缺陷。近來，高通量芯片技術已經被發展用來檢測DNA 結合蛋白。然而，已經報道的芯片檢測方法仍存在較多缺點，如檢測蛋白直接標 記法會降低蛋白與DNA間的結合活性；還有些方法需要抗體對蛋白進行標記，這 樣給微量蛋白的檢測造成極大的困難。此外，熒光探針技術也被用來檢測DNA結 合蛋白。但是以往報導方法中，一方面要用不同的熒光探針檢測不同的蛋白，這 樣導致了檢測成本的增加；另一方面，檢測靈敏度不夠高還會造成微量樣本檢測 的困難。目前，生物醫學研究和臨床檢測上，急需要一種超高靈敏度、低成本且 高通量DNA結合蛋白的檢測方法。

發明內容

針對以上技術缺陷，本發明提供一種DNA結合蛋白高靈敏高通量的檢測方法。 它是基于微陣列芯片的高靈敏、低成本檢測DNA結合蛋白的高通量方法。由本發 明制得的DNA結合蛋白檢測芯片，具有DNA結合蛋白檢測的超靈敏、高特異以及 低成本和省時省力的特點，可以廣泛應用于科研和臨床檢測診斷之中。

本發明是以如下技術解決方案實現的：一種DNA結合蛋白的檢測方法，首先 設計寡核苷酸DNA芯片；將待篩選的粗細胞提取液同寡核苷酸DNA芯片直接溫育； 再將核酸外切酶III放入上述寡核苷酸DNA芯片體系中溫育；再將環形探針加入 寡核苷酸DNA芯片體系中，進行滾環擴增，有結合蛋白的序列能進行擴增獲得熒 光信號，而沒有被蛋白的結合的序列，被核酸外切酶III所切割則不能進行滾環 擴增，不能獲得熒光信號；最后通過微陣列熒光信號的有無來判斷芯片體系中DNA 結合蛋白的有無，通過熒光強度則能夠定量檢測出DNA結合蛋白含量。

所述的寡核苷酸DNA芯片由芯片和被固定到芯片上的的寡核苷酸組成。

所述的寡核苷酸DNA的芯片是普通玻璃片或是微球；其表面修飾是聚丙烯酰 胺修飾、醛基修飾或鏈霉親和素修飾；而相對應的被固定的寡核苷酸的5’端則是 丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。

所述的被固定到芯片上的的寡核苷酸是雙鏈的寡核苷酸，或是單鏈的寡核苷 酸；通過延伸的方法得到雙鏈的寡核苷酸芯片，或是通過具有發夾結構的單鏈寡 核苷酸通過自身返折成發夾，最后形成具有雙鏈DNA芯片。

所述的的微陣列信號通過和環形探針特定片段互補的熒光探針雜交得到；或 通過滾環過程中熒光標記的dNTP參入到延伸核苷酸序列上得到；或者通過滾環擴 增后得到的單鏈DNA延伸成雙鏈DNA后，再同SUBGREEN染料結合后得到。

所述的環形探針是人工合成的，或是人工合成后經過連接而成的。

所述的環形探針的結構，它的一個片段同固定于芯片的寡核苷酸特定片段相 互補，包括蛋白結合的DNA序列；其另一部分片段則同熒光檢測探針的序列相同。

所述的環形探針其結構還在于一個片段同固定于芯片的寡核苷酸的特定片段 相互補，其發夾轉彎處15-20個通用堿基；其另一部分片段則同熒光檢測探針的 序列一樣。