[發(fā)明專利]一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910032411.8
• 申請日: 2009-06-13
• 公開（公告）號: CN101591705A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘志強;張勵才;邵翠杰;張成標
• 申請（專利權(quán)）人: 徐州醫(yī)學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務(wù)所
• 代理人: 周愛芳

1.一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方法，其特征在于其具體步驟為： 首先設(shè)計寡核苷酸DNA芯片；將待篩選的粗細胞提取液同寡核苷酸DNA芯片直接 溫育；再將核酸外切酶III放入上述寡核苷酸DNA芯片體系中溫育；再將環(huán)形探 針加入寡核苷酸DNA芯片體系中，進行滾環(huán)擴增，有結(jié)合蛋白的序列能進行擴增 獲得熒光信號，而沒有被蛋白的結(jié)合的序列，被核酸外切酶III所切割則不能進 行滾環(huán)擴增，不能獲得熒光信號；最后通過微陣列熒光信號的有無來判斷芯片體 系中DNA結(jié)合蛋白的有無，通過熒光強度則能夠定量檢測出DNA結(jié)合蛋白含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方法，其特 征在于寡核苷酸DNA芯片由芯片和被固定到芯片上的的寡核苷酸組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方法， 其特征在于寡核苷酸DNA芯片是普通玻璃片或是微球；其表面修飾是聚丙烯酰胺 修飾、醛基修飾或鏈霉親和素修飾；而相對應(yīng)的被固定的寡核苷酸的5’端則是丙 烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測 方法，其特征在于被固定到芯片上的寡核苷酸是雙鏈的寡核苷酸，或是單鏈的寡 核苷酸；通過延伸的方法得到雙鏈的寡核苷酸芯片，或是通過具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單 鏈寡核苷酸通過自身返折成發(fā)夾，最后形成具有雙鏈DNA芯片。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方法，其特 征在于所述的微陣列信號通過和環(huán)形探針特定片段互補的熒光探針雜交得到；或 通過滾環(huán)過程中熒光標記的dNTP參入到延伸核苷酸序列上得到；或者通過滾環(huán)擴 增后得到的單鏈DNA延伸成雙鏈DNA后，再同SUBGREEN染料結(jié)合后得到。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方法， 其特征在于所述的環(huán)形探針是人工合成的，或是人工合成后經(jīng)過連接而成的。

7.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方 法，其特征在于所述的環(huán)形探針的結(jié)構(gòu)，它的一個片段同固定于芯片的寡核苷酸 特定片段相互補，包括蛋白結(jié)合的DNA序列；其另一部分片段則同熒光檢測探針 的序列相同。

8.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種DNA結(jié)合蛋白高靈敏高通量的檢測方 法，其特征是所述的環(huán)形探針其結(jié)構(gòu)還在于一個片段同固定于芯片的寡核苷酸的 特定片段相互補，環(huán)形探針發(fā)夾轉(zhuǎn)彎處15-20個通用堿基；其另一部分片段則同 熒光檢測探針的序列一樣。