[發(fā)明專利]一種羅丹明B完全抗原的合成方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910031727.5
• 申請日: 2009-06-20
• 公開（公告）號: CN101585877A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胥傳來;宋珊珊;林菲
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/34;C07K1/113
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務(wù)所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種羅丹明B完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羅丹明B，英文名：Rhodamine?B；CAS：81-88-9，分子式C₂₈H₃₁ClN₂O₃；羅 丹明B是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，在溶液中有強烈的熒光，用作 實驗室中細胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。其為三苯甲烷類 堿性染料，具有潛在的致癌和致突變性，我國和歐盟等都不允許在食品中使用。 羅丹明B具有脂溶性，被用作調(diào)味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色劑。使用 了被污染的調(diào)味品制作的食品時會造成殘留。調(diào)味品使用羅丹明B染色時含量 較高，甚至直接摻入，可進行現(xiàn)場檢測。食品中因其含量較低，需送實驗室檢 測。可能添加的食品類別為調(diào)味品。現(xiàn)有的儀器檢測法很難實現(xiàn)對羅丹明B 進行快速、準確、多殘留的檢測。目前國內(nèi)外尚未有理想的針對羅丹明B多殘 留免疫檢測方法的報道。為了彌補這一空白，設(shè)計了以羅丹明B自身為半抗原 的合成羅丹明B免疫檢測的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種羅丹明B完全抗原的合成方法。所制備的產(chǎn)品用 于羅丹明B的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種羅丹明B完全抗原的合成方法，以羅丹明B為半 抗原，用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶 聯(lián)比；步驟為：

(1)羅丹明B完全抗原的合成：

配制A液：20mg羅丹明B溶于1mL?DMF中，全溶后冰浴下加10μL三丁 氨混勻后再加10μL氯甲酸異丁酯磁力攪拌1h；

配制B液：40mg?BSA溶于3mL?pH?7.4的磷酸鹽緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆茫?

冰浴下將A液逐滴加入B液中，然后置4℃下溫孵3h，即得羅丹明B完全 抗原混合液；

透析袋前處理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離 子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；

透析：將羅丹明B完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4 的磷酸鹽緩沖溶液和2×2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中 的液體制成粉末，即得到羅丹明B完全抗原；

(2)羅丹明B完全抗原的鑒定：羅丹明B完全抗原采用分光光度法鑒定 其偶聯(lián)結(jié)果，利用牛血清蛋白標準液得到標準曲線，從曲線上比對得到抗原溶 液的蛋白濃度，計算摩爾吸光系數(shù)ε，再測定羅丹明B完全抗原的偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比測定：是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃 度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián) 物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。

偶聯(lián)物蛋白濃度測定：配制濃度為0，40，60，80，100μg·mL^-1的牛血清蛋 白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30℃水浴溫熱5分鐘， 每個濃度做平行樣，在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。 將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得 到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。

摩爾吸光系數(shù)ε：配制羅丹明B濃度為0，10，20，30μg·mL^-1的20％乙醇 溶液，通過紫外掃描可知羅丹明B的最大吸收波長為564nm，在564nm處測吸 光值，每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為：ε＝吸光值/摩爾濃度。