[發明專利]一種人外周血RORγt轉錄本熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200910030211.9
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101580874A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 王勝軍;王海生;彭素芳;陳建國;吳朝陽;史燁;楊先知;許化溪
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及一種人外周血單個核細胞ROR?γ?t轉錄本熒光定量PCR檢測方法。屬于生 物技術領域。

背景技術

天然CD4⁺T細胞是包括許多亞群的異質性細胞。在體內微環境的作用下，能分化成不 同類型具有不同免疫功能的細胞群。經典的觀點認為它在體內分化為Th1和Th2兩種細胞 群體。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-β，主要介導細胞免疫。而Th2主要分泌TGF- β和IL-6，介導體免疫和抗寄生蟲感染。后來又提出了一個新亞群---調節性T細胞(Treg細 胞)，此細胞在體內調節Th細胞和Tc細胞使之處于動態平衡從而維護機體的免疫自身穩 定.。最近，Harrington等根據分泌的細胞因子不同又發現了一種新的CD4⁺T細胞亞群Th17 細胞。此細胞分泌的效應因子主要是IL-17。爾后由此誘生出其它細胞因子如IL-6、TNF- α等、基質金屬激酶(MMP)和趨化因子如MCP-1、MIP-2、CLCL-1、CXCL5等，從 而引發炎癥導致其他疾病如自身免疫性疾病、慢性炎癥、腫瘤等。在研究Th17細胞的分化 過程中，發現了其特異性轉錄因子孤獨核受體(RORγt)，此轉錄因子在TGF-β和IL-6共 同誘導下是IL-17基因表達的關鍵性調控因子。因此，檢測此轉錄因子水平，可以間接地 反映出IL-17基因的表達水平，從而為研究TH17細胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎 癥、腫瘤等疾病中的作用有著重要的臨床和科研意義。

轉錄因子的檢測方法以目前技術手段主要有兩種，其一是利用熒光標記的抗轉錄因子 抗體，通過流式細胞儀從蛋白水平來檢測。此方法盡管特異性強，但因操作過程中需要特 異性抗體、流式細胞儀等試劑和儀器，代價較高且操作繁瑣，故難于推廣。其二是利用聚 合酶鏈反應(PCR)技術從基因水平來檢測。常規PCR只能定性且靈敏度低、污染強，而 熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強、無污染且實時、定量、快速等特點。但熒光定量 PCR技術對特異性要求較高，目前，還沒有實時、快速、準確地檢測人外周血單個核細胞 孤獨核受體(RORγt)的檢測方法。

發明內容

為了填補人外周血單個核細胞孤獨核受體(RORγt)轉錄因子在檢測方法方面的空白。 本發明采用熒光定量PCR技術提供了一種能夠實時、準確、快速檢測人外周血單個核細胞 孤獨核受體(RORγt)轉錄因子的檢測方法。

鑒于熒光定量PCR技術對檢測過程中特異性要求較高，本發明是通過以下方法來提高 檢測特異性的：

(1)利用Oligo?6.0和Primer?primer5.0軟件設計多對引物，并進行PCR擴增，通過瓊 脂糖凝膠電泳，選取目的條帶單一且產量最多的引物作為熒光定量PCR引物。

(2)優化PCR反應體系，如通過改變引物濃度、提高退火溫度等方法減少非特異性擴 增，提高特異性。

(3)根據引物二聚體和目的基因Tm值不同，按照張馳宇等推薦熒光定量PCR四步法 收集熒光，排除引物二聚體對檢測結果干擾，提高反應特異性。

本發明所采用的技術方案如下：

一種人外周血單個核細胞RORγt轉錄本熒光定量PCR檢測方法，是：首先設計特異 性熒光定量引物，然后建立實時定量PCR反應體系和反應程序，制備含有目的片斷的質粒 作為標準質粒繪制標準曲線，之后將待測樣品與標準質粒同時擴增，根據標準曲線確定樣 品中目的基因的拷貝數。

其中特異性熒光定量引物，其序列如下：

正向引物：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’

反向引物：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’

其中標準質粒所含目的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本發明檢測方法中，所述熒光定量PCR反應體系由下列組分構成：10μl?2×SYBR MIX，20μM正向引物、反向引物各0.2μl，0.12μl?Taq酶，1μl標準質粒或樣本cDNA， 補充滅菌水至于20μl。

本發明檢測方法中，所述PCR反應程序為94℃?5min，94℃30sec，65℃?30sec，72℃ 30sec，88℃?10sec收集熒光，擴增40個循環，72℃?7min。