[發(fā)明專利]一種殘殺威人工抗原及其合成方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910029608.6
• 申請(qǐng)日: 2009-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN101519367A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅世能;桑光明;林建國(guó);王洪勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C07C271/44
• 分類號(hào): C07C271/44;C07K14/765;G01N33/566;G01N21/33
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種殘殺威人工抗原及其合成方法，屬于有機(jī)化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明合成的殘殺威人工抗原用于制備特異性識(shí)別化學(xué)農(nóng)藥殘殺威的抗體和研制高效快速檢測(cè)殘殺威含量的免疫速測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

殘殺威(Propoxur)屬于氨基甲酸酯類化學(xué)殺蟲劑，是世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)并推薦的家庭衛(wèi)生害蟲防治的四個(gè)氨基甲酸酯類殺蟲劑之一。由德國(guó)拜耳公司首先開發(fā)成功，國(guó)家“七五”引進(jìn)品種。殘殺威制劑主要用于經(jīng)濟(jì)作物害蟲防治(如棉蚜、菜蚜等)，以及消滅家庭及公共場(chǎng)所的各種衛(wèi)生害蟲(蚊、蠅、蟑螂等)，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，擊倒快，持效期長(zhǎng)，且殺蟲譜廣、殘效長(zhǎng)、殺死率高等特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)已有廠家進(jìn)行原藥和制劑的大規(guī)模生產(chǎn)并得到很好的推廣。

國(guó)內(nèi)外對(duì)殘殺威檢測(cè)方法進(jìn)行了眾多研究。文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)殘殺威有效成分檢測(cè)方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法等，但是這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要昂貴的設(shè)備、專門的操作人員、樣品處理復(fù)雜、成本高、時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足快速簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求和大面積推廣使用。而酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)由于具有特異、敏感、簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低及樣品純化要求低等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留分析中顯示了廣闊的應(yīng)用前景。

由于大多數(shù)農(nóng)藥為小分子物質(zhì)(分子量小于1000)，本身不具有免疫原性(稱為半抗原)，必須與大分子載體偶聯(lián)制備人工抗原，才能誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。為此，必須設(shè)法先將農(nóng)藥小分子與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備出農(nóng)藥人工抗原。然而殘殺威分子不能直接通過雙功能交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)，需要先通過化學(xué)反應(yīng)在農(nóng)藥分子上引入活性功能團(tuán)，以此作為半抗原，再使之與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。因此半抗原的設(shè)計(jì)、合成是建立殘殺威酶聯(lián)免疫分析方法的關(guān)鍵所在。

關(guān)于殘殺威半抗原的合成，目前只有Maria?J.Moreno(J.Agric.Food?Chem.2001，49，72-78)等人在2001年報(bào)道的一種合成方法，他們用鄰-異丙氧基苯酚與劇毒品光氣反應(yīng)制備鄰-異丙氧苯氧甲酰氯，進(jìn)而與γ-丁胺酸反應(yīng)制備半抗原，反應(yīng)式如下：

該半抗原合成方法中使用到劇毒性物質(zhì)光氣，而且反應(yīng)條件較為苛刻，這將成為殘殺威試劑盒的研制與大批量生產(chǎn)難以突破的瓶頸。再者殘殺威苯環(huán)上N-甲基氨基甲酸酯鍵作為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的特征結(jié)構(gòu)，而上述半抗原的合成恰恰是從該特征結(jié)構(gòu)一端引入活性基團(tuán)羧基，這勢(shì)必將會(huì)給后期的ELISA分析中帶來一定的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的殘殺威人工抗原及其合成方法，為進(jìn)一步研究殘殺威的酶聯(lián)免疫殘留分析法提供了試驗(yàn)手段。

本發(fā)明在未破壞殘殺威母體結(jié)構(gòu)情況下，在苯環(huán)上順利地引入活性基團(tuán)氨基(-NH₂)，制備出半抗原Hapten?1，繼而在氨基上延長(zhǎng)連接臂引入4個(gè)碳的羧酸基團(tuán)(-COOH)，制備出半抗原Hapten?2。通過簡(jiǎn)單的3步反應(yīng)，制備出了具有不同的活性基團(tuán)、不同的連接臂長(zhǎng)的兩種半抗原，而且反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單。

其次，具有不同活性基團(tuán)的半抗原Hapten?1與Hapten?2可以與不同的載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原。在本發(fā)明中，選用最為常用且理化性質(zhì)穩(wěn)定、廉價(jià)易得的牛血清白蛋白(BSA)作為載體蛋白分別與半抗原Hapten?1及Hapten?2通過重氮法及混合酸酐法成功偶聯(lián)，制備出人工抗原1與人工抗原2。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種殘殺威半抗原，以殘殺威2-(1-異丙氧基)苯基甲基氨基甲酸酯為原料，依次進(jìn)行硝化反應(yīng)，還原反應(yīng)，制得殘殺威半抗原Hapten?1，然后對(duì)Hapten?1酰化制得殘殺威半抗原Hapten?2；

所述殘殺威半抗原Hapten?1，化學(xué)名稱為2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯；

及所述殘殺威半抗原Hapten?2，化學(xué)名稱為4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸。

一種殘殺威人工抗原，用所述的殘殺威半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)而得的產(chǎn)物；

殘殺威人工抗原1，其化學(xué)名稱為2-異丙氧基-5-氨基苯基-N-甲基氨基甲酸酯-牛血清白蛋白，簡(jiǎn)稱為抗原Hapten?1-BSA；

及殘殺威人工抗原2，其化學(xué)名稱為4-[4-異丙氧基-3-(N-甲基氨基甲酸酯基)苯胺基]-4-羰基丁酸-牛血清白蛋白，簡(jiǎn)稱為抗原Hapten?2-BSA。

所述的殘殺威半抗原的制備方法，制備殘殺威半抗原Hapten?1及殘殺威半抗原Hapten?2：