[發(fā)明專利]一種生物發(fā)酵提純他克莫司的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910029010.7
• 申請日: 2009-01-20
• 公開（公告）號: CN101481715A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊文革;胡永紅;陳林
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及生物發(fā)酵，生物制藥，發(fā)酵產(chǎn)物的提取、分離和純化方法，特別涉及一種生物發(fā)酵提純他克莫司的方法。

背景技術(shù)

他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)是由日本藤澤藥品工業(yè)公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌(Streptomyces?tsukubaensis)No.9993的發(fā)酵液中提取得到的一種新型二十三元大環(huán)內(nèi)酯聚酮免疫抑制劑。臨床研究表明，其免疫抑制活性是環(huán)孢菌素A的10～100倍。目前已廣泛應(yīng)用于肝臟、骨髓移植、對其他藥物耐藥腎移植的排斥防治、白塞氏病、變應(yīng)性皮炎、銀屑病、魚鱗病、斑禿、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化病、糖尿病等多種自身免疫疾病的治療。自在中國上市的短短時間內(nèi)，市場份額迅速上升，已成為肝臟及腎臟移植后排斥反應(yīng)的臨床一線藥物。

他克莫司的合成方法主要有：①生物發(fā)酵法。主要由筑波鏈霉菌(Streptomyces?tsukubaensis)、吸水鏈霉菌(Streptomyces?hygroscopicus)生物發(fā)酵得到。Kino?T.等1984年首次從筑波鏈霉菌中分離出他克莫司。②有機合成法。Todd?K.Jones等1990年在歐洲專利EP378,318中首次公布了他克莫司的有機合成方法。由于他克莫司是二十三元大環(huán)內(nèi)酯，有機合成過程中工藝步驟繁多，反應(yīng)條件苛刻，合成成本昂貴。因此主要用生物發(fā)酵法制備他克莫司。

國內(nèi)在他克莫司提純方面的研究起步較晚。從90年代中后期華北制藥和華東制藥對他克莫司產(chǎn)生菌進行了初步誘變選育，上海農(nóng)藥所公開了一株新的他克莫司產(chǎn)生菌及生產(chǎn)方法，發(fā)酵產(chǎn)物他克莫司的平均濃度為150μg/mL，但對于如何分離提取產(chǎn)物并未具體說明。國外分離提純他克莫司主要有兩種方法：①分別加工菌絲體和發(fā)酵液，如Kino?T.et?al.J.Antibiot.1987，40，1249-1255中所述。②利用疏水性溶劑直接萃取發(fā)酵液，如專利WO03/68980中所述。由于發(fā)酵液中存在多種他克莫司類似物，生物效價不高，并且存在于菌絲體和發(fā)酵液之中，有效的分離提純他克莫司很有難度，使得國內(nèi)在發(fā)酵液中提純他克莫司的主要技術(shù)研究方面尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷或不足，提供一種采用生物發(fā)酵提純他克莫司的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：利用自主篩選鑒定的鏈霉菌Streptomyces?sp.NJYH2618，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含他克莫司的發(fā)酵液，他克莫司發(fā)酵液經(jīng)種子的培養(yǎng)、接種前準備及接種、多階段溶氧控制、分批補料發(fā)酵階段得到，具體培養(yǎng)方法見本發(fā)明人申請的專利(申請?zhí)枮?00810234807.6)；并采用菌絲體抽提、發(fā)酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結(jié)晶技術(shù)得到他克莫司純品。本發(fā)明操作方便、工藝簡單、成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案：一種生物發(fā)酵提純他克莫司的方法，其特征在于利用自主篩選鑒定的鏈霉菌Streptomyces?sp.NJYH2618，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含他克莫司的發(fā)酵液，采用菌絲體抽提、發(fā)酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結(jié)晶技術(shù)得到他克莫司純品。

具體步驟如下：

1)用發(fā)酵過濾后的菌絲體5～10倍體積的有機溶劑抽提2～3次鏈霉菌Streptomycessp.NJYH2618發(fā)酵過濾后的菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；

2)用發(fā)酵上清液1～2倍體積的疏水性溶劑萃取鏈霉菌Streptomyces?sp.NJYH2618發(fā)酵上清液，控制溶液溫度和pH值，得疏水性萃取液；

3)合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經(jīng)超濾膜過濾后，進入裝有大孔樹脂的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1∶5～1∶20，用1～4倍大孔樹脂體積的有機溶劑進行沖洗，并用1/3～1倍大孔樹脂體積的有機溶劑進行解吸，控制溶液溫度和pH值，得解吸液；

4)真空濃縮解吸液，并用1～4倍解吸液體積的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水，再次真空濃縮；將真空濃縮后的濃縮液經(jīng)與濃縮液體積比為1∶10～1∶20的甲醇-水混合溶液溶解，在反相硅膠柱中用和濃縮液體積比為1∶2～1∶7的硅膠進行層析分離，用2～3倍硅膠體積的洗脫劑進行洗脫，收集含他克莫司的活性組分；

5)真空濃縮含他克莫司的活性組分，并將活性組分溶于2～5倍體積的結(jié)晶溶劑中冷卻結(jié)晶得到他克莫司。