[發明專利]一種生物發酵提純他克莫司的方法

有效

• 申請號: 200910029010.7
• 申請日: 2009-01-20
• 公開（公告）號: CN101481715A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 楊文革;胡永紅;陳林
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

1.一種生物發酵提純他克莫司的方法，其特征在于利用自主篩選鑒定的鏈霉菌Streptomyces?sp.NJYH2618，通過微生物發酵培養出含他克莫司的發酵液，采用菌絲體抽提、發酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結晶技術得到他克莫司純品；具體步驟如下：

1)用發酵過濾后的菌絲體5～10倍體積的有機溶劑抽提2～3次鏈霉菌Streptomyces?sp.NJYH2618發酵過濾后的菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；其中有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯或甲醇；

2)用發酵上清液1～2倍體積的疏水性溶劑萃取鏈霉菌Streptomyces?sp.NJYH2618發酵上清液，控制溶液溫度為15～35℃和pH值為6-12，得疏水性萃取液；

3)合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經超濾膜過濾后，進入裝有大孔樹脂的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1∶5～1∶20，用1～4倍大孔樹脂體積的有機溶劑進行沖洗，并用1/3～1倍大孔樹脂體積的有機溶劑進行解吸，控制溶液溫度為15～35℃和pH值為6-12，得解吸液；其中沖洗的有機溶劑為體積濃度45～55％丙酮或甲醇；解吸的有機溶劑為體積濃度70～80％丙酮或甲醇；

4)真空濃縮解吸液，并用1～4倍解吸液體積的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水，再次真空濃縮；將真空濃縮后的濃縮液經與濃縮液體積比為1∶10～1∶20的甲醇-水混合溶液溶解，其中甲醇和水混合溶液中甲醇和水的體積比為1∶1～1∶1.5；在反相硅膠柱中用和濃縮液體積比為1∶2～1∶7的硅膠進行層析分離，用2～3倍硅膠體積的洗脫劑進行洗脫，收集含他克莫司的活性組分；其中洗脫劑為體積濃度50～75％甲醇或乙醇；

5)真空濃縮含他克莫司的活性組分，并將活性組分溶于2～5倍體積的結晶溶劑中冷卻結晶得到他克莫司。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2)中疏水性溶劑為丙酮、乙酸乙酯或甲苯。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟5)中結晶溶劑為乙腈、甲醇或乙醇。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟4)中用乙酸乙酯或丙酮提取解吸液的次數為2-3次；步驟5)中結晶溫度為5～25℃，結晶時間為15～60小時。