[發(fā)明專利]來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌的培養(yǎng)方法及其用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910028902.5
• 申請(qǐng)日: 2009-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN101481671A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬桂珍;暴增海;夏振強(qiáng);劉云鶴;王偉霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/05
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司
• 代理人: 劉喜蓮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種菌種的培養(yǎng)方法，特別是一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌的培養(yǎng)方法；本發(fā)明還涉及糞產(chǎn)堿桿菌的用途。

背景技術(shù)

目前，植物病害主要依賴化學(xué)殺菌劑防治，由于過量的使用導(dǎo)致了環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染，同時(shí)一些病原菌對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。生物防治的方法彌補(bǔ)了化學(xué)防治的不足，日益受到重視，已經(jīng)成為植物病害防治的重要手段。但目前用于生物防治的微生物菌株多數(shù)來自于陸地，而多年來對(duì)陸地微生物的篩選，導(dǎo)致篩選到產(chǎn)生新型抗病機(jī)制的微生物的幾率越來越少，因而越來越多的人們把目光投向了海洋，希望從海洋環(huán)境中極其具多樣性的微生物中開發(fā)出新型抗病原菌活性物質(zhì)，用于植物病害的生物防治。近幾年以來，從海洋中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質(zhì)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，海洋微生物已經(jīng)成為農(nóng)用抗生素的新資源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對(duì)9種植物病原真菌有強(qiáng)抗菌作用的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(Alcaligenes?faecalisstrain?KZJ01)的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(Alcaligenes?faecalis?strain?KZJ01)的培養(yǎng)方法，其特點(diǎn)是，其具體分離培養(yǎng)步驟如下：

(1)富集培養(yǎng)：從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有10mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，170r/min，25℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48h；

(2)菌體的分離：搖床培養(yǎng)48h后，用移液槍取富集培養(yǎng)48h的富集培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10^-1的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的樣品稀釋液；然后分別取10^-5、10^-6和10^-7的樣品稀釋液0.2ml放到2216E固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，長出菌落；

(3)菌株的純化：分別挑取2216E固體培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到2216E固體培養(yǎng)基平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到2216E試管斜面中保存；

(4)菌株篩選：按下述方法分別對(duì)上述若干個(gè)純化的菌株進(jìn)行抑制植物病原真菌實(shí)驗(yàn)；取純化的菌株分別在2216E固體培養(yǎng)基平板上活化培養(yǎng)24小時(shí)，取9種植物病原真菌分別在PDA平板上活化培養(yǎng)3d；然后在PDA平板的中央接種活化3d的直徑為5mm的植物病原真菌的菌苔，培養(yǎng)24小時(shí)后，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿邊緣15mm處劃線接種1cm活化24小時(shí)的純化的菌株，25℃倒置恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況，培養(yǎng)5d后測(cè)量抑菌帶寬度；以不接菌為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；選取一株對(duì)9種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于10mm的菌株，記為KZJ01菌株；

(5)菌株的鑒定：將KZJ01菌株于25℃下培養(yǎng)24h，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、生長需要NaCl試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)，并進(jìn)行16S?rDNA測(cè)序分析；結(jié)果為：KZJ01菌株革蘭氏染色陰性，無芽孢，細(xì)胞桿狀；沒有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)；在2216E固體培養(yǎng)基平板上菌落乳白半透明，邊緣整齊；KZJ01菌株氧化酶反應(yīng)陽性，好氧，性質(zhì)初步鑒定為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)；16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于Alcaligenes?faecalis，二者的16S?rDNA序列相似性為99％，該菌株即為糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(Alcaligenes?faecalis?strain?KZJ01)。

本發(fā)明技術(shù)方案中所述的菌株的鑒定方法中涉及的菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、生長需要NaCl試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)及16S?rDNA測(cè)序分析的實(shí)驗(yàn)及分析方法均采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法。16S?rDNA測(cè)序分析得到的16S?rDNA已在Genebank公開。