[發明專利]來自海洋的糞產堿桿菌的培養方法及其用途

無效

• 申請號: 200910028902.5
• 申請日: 2009-01-21
• 公開（公告）號: CN101481671A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 馬桂珍;暴增海;夏振強;劉云鶴;王偉霞
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/05
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司
• 代理人: 劉喜蓮

1、一種來自海洋的糞產堿桿菌KZJ01(Alcaligenes?faecalis?strainKZJ01)的培養方法，其特征在于，其具體分離培養步驟如下：

(1)富集培養：從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有10mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養液中，170r/min，25℃條件下搖床培養48h；

(2)菌體的分離：搖床培養48h后，用移液槍取富集培養48h的富集培養液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10^-1的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續稀釋，分別制備成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的樣品稀釋液；然后分別取10^-5、10^-6和10^-7的樣品稀釋液0.2ml放到2216E固體培養基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25℃的培養箱中培養24h，長出菌落；

(3)菌株的純化：分別挑取2216E固體培養基平板上的菌落，用三區劃線的方法接種到2216E固體培養基平板上，置于25℃培養箱中培養，反復劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個純化的菌株分別轉接到2216E試管斜面中保存；

(4)菌株篩選：按下述方法分別對上述若干個純化的菌株進行抑制植物病原真菌實驗；取純化的菌株分別在2216E固體培養基平板上活化培養24小時，取9種植物病原真菌分別在PDA平板上活化培養3d；然后在PDA平板的中央接種活化3d的直徑為5mm的植物病原真菌的菌苔，培養24小時后，在植物病原真菌四周距培養皿邊緣15mm處劃線接種1cm活化24小時的純化的菌株，25℃倒置恒溫培養，觀察病原菌的生長狀況，培養5d后測量抑菌帶寬度；以不接菌為對照，實驗重復3次；選取一株對9種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于10mm的菌株，記為KZJ01菌株；

(5)菌株的鑒定：將KZJ01菌株于25℃下培養24h，觀察記錄菌落和細胞形態，同時進行革蘭氏染色、運動性試驗、過氧化氫酶試驗、生長需要NaCl試驗、淀粉水解試驗和硝酸鹽還原試驗，并進行16S?rDNA測序分析；結果為：KZJ01菌株革蘭氏染色陰性，無芽孢，細胞桿狀；沒有鞭毛，不能運動；在2216E固體培養基平板上菌落乳白半透明，邊緣整齊；KZJ01菌株氧化酶反應陽性，好氧，性質初步鑒定為產堿菌屬(Alcaligenes)；16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于Alcaligenes?faecalis，二者的16S?rDNA序列相似性為99％，該菌株即為糞產堿桿菌KZJ01(Alcaligenes?faecalis?strain?KZJ01)。

2、權利要求1所述的糞產堿桿菌KZJ01(Alcaligenes?faecalis?strainKZJ01)的抑制植物病原真菌的用途。