[發明專利]廢水生物處理反應器中微生物群落組成的快速分子檢測方法

有效

• 申請號: 200910028319.4
• 申請日: 2009-01-13
• 公開（公告）號: CN101475987A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 任洪強;符波;丁麗麗;梁睿;廖瀟逸
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C02F3/34
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司
• 代理人: 湯志武;王鵬翔

技術領域

本發明涉及到利用PCR-DGGE技術設計構建DGGE?Marker對廢水生物處理反應器 中顆粒污泥、活性污泥、生物膜等樣品中微生物群落組成從而進行快速分析檢測的技 術，屬于環境微生物分子生態學領域。

背景技術

廢水生物處理技術是目前世界上處理市政廢水和有機工業廢水的主要方法。為了 提高廢水處理性能和穩定性，人們對反應器的設計和操作條件進行了大量研究。廢水 處理過程中主要是依賴以活性污泥(包括顆粒污泥)和生物膜為核心的微生物群落來 降解和轉化污染物，但由于研究技術和手段的缺乏，人們只能把反應器中的微生物群 落看作是一個“黑箱”，把整個廢水處理過程當做一個物理化學過程，通過控制和監控生 物反應器的物化參數來實現廢水的無害化排放。但這些操作條件是否破壞微生物群落 的正常結構，是否能夠長期穩定地達到廢水的高效處理，都是工程師們和微生物學家 熱衷的問題。因此需對參與廢水處理的微生物群落中各個種群的組成、豐度、分布及 其在環境中生理生化特性進行整理全面研究，并且以此為基礎適當改變反應器設計或 者操作條件，以適應廢水生物處理中涉及的微生物的生長，才能更好的優化反應器的 設計和性能，提高生物處理的效率。

目前自然界中只有極少部分微生物能夠被分離和純化，因此傳統的微生物培養和 鑒定方法不足以代表微環境中的真實情況。基于16S?rDNA的免純培養技術的分子生物 學研究手段，例如末端限制性片段長度多態性分析、單鏈構象多態性分析、熒光原位 雜交技術等逐步被引入到環境微生物學研究中，已經將環境微生物領域研究帶入一個 革命性的新時代。變性梯度凝膠電泳(Denaturing?Gradient?Gel?Electrophoresis，DGGE) 技術直接利用DNA及RNA對微生物遺傳特性進行表征，不但避免了傳統上耗時的菌種 分離，更可進而鑒定出無法利用傳統方法分離出來的菌種。

傳統培養方法和構建克隆文庫等微生物群落組成分析方法，效率較低。目前有利 用DGGE技術分析城市污水廠污泥和工業廢水處理中的微生物群落的專利申請，如同濟 大學提出的分析城市污水廠污泥微生物群落構成的方法(CN1584051)，上海交通大學 發明的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法(CN1995389)，但未涉及如何 進一步縮短利用DGGE技術檢測時間更加快速檢測廢水生物處理中微生物群落。

發明內容

本發明的目的是提供一種縮短微生物群落組成的檢測周期的檢測技術，即微生物 群落樣品DNA的PCR再經DGGE分離獲取條帶所代表的微生物種類的信息來設計構 建變性梯度凝膠電泳Marker作為對照標準，對廢水生物處理反應器中顆粒污泥、活性 污泥、生物膜等樣品中微生物群落組成從而進行快速分析檢測的技術。

本發明技術方案是：

廢水生物處理反應器中微生物群落組成的快速分子檢測方法，

①收集廢水生物處理反應器中微生物樣品進行預處理，利用苯酚-氯仿法提取基因 組總DNA；

②設計16S?rDNA?V3區引物[341F-GC和518R(細菌)；344F-GC和518R(古菌)]對樣 品DNA進行PCR擴增；

③利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術分析PCR擴增產物；

④得到的DGGE圖譜利用Quantity?one軟件分析，并根據切膠測序特征DGGE條帶， 對所代表的微生物進行鑒定；

⑤根據條帶所代表的微生物種類來設計構建變性梯度凝膠電泳集合庫DGGE Marker作為快速分子檢測的對照標準。所述變性梯度凝膠電泳集合庫DGGE?Marker是根 據PCR產物經DGGE分離后的條帶通過切膠克隆測序然后在Genbank中同源比對明確其 代表的微生物種類來設計構建的；直接采用已知條帶的PCR產物混合或者將已知條帶所 對應的純培養物DNA進行PCR擴增產物混合，從而作為快速分子檢測方法的對照標準。

根據DGGE分離后的條帶經測序并在Genbank中比對，判斷其代表的微生物種類來 設計構建DGGE?Marker作為分子檢測的對照標準，從而對廢水生物處理反應器中顆粒污 泥、活性污泥、生物膜等樣品中微生物群落組成進行快速分析。